消栓飲對創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓大鼠血漿TXB2/6-Keto-PGF1α的影響

汪 能，王 勇*，張 棟，黃永松，胡 擁

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)指在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)的血液，使靜脈血管流通不暢或阻塞，血液回流受阻，從而引起深靜脈的功能障礙。其發(fā)病率較高，危害性大，可引起肺栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥。 骨科手術(shù)后發(fā)病率尤高，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：在沒有采取任何防治措施的臨床骨科術(shù)后，DVT 的發(fā)生率可能高達(dá)40%～60%[1]。 在目前的中醫(yī)領(lǐng)域中，對于DVT 的防治并沒有統(tǒng)一且規(guī)范的方案。王勇教授依據(jù)豐富的理論知識(shí)和多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)辨證論治思想的指導(dǎo)下， 擬方消栓飲用于防治下肢DVT 形成，取得的臨床療效頗佳[2]，并進(jìn)行了關(guān)于消栓飲對DVT 形成的血液流變學(xué)影響實(shí)驗(yàn)研究[3]。 為進(jìn)一步明確消栓飲的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)觀察其對DVT 模型大鼠血漿血栓素B2（TXB2）及6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康的SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量（240±10）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYSK（湘）2013-0005，質(zhì)量合格證：NO.43004700005816，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 （1）消栓飲組成：黃芪50 g，白芍30 g，丹參30 g，茯苓10 g，桂枝6 g，當(dāng)歸尾10 g，川牛膝15 g，陳皮10 g，枳殼10 g，大腹皮15 g，澤瀉10 g，豬苓10 g，甘草6 g，由中藥煎藥機(jī)統(tǒng)一煎制； 將中藥液經(jīng)恒溫水浴制作成120 mL 濃縮藥液，其藥液濃度為1.77 g/mL，封包備用。 （2）低分子肝素鈉注射液，昆明積大制藥股份公司，0.4 mL：4 250 IUaXa，生產(chǎn)批號(hào)：140301、140501。

1.1.3 主要設(shè)備及試劑 （1）TXB2及6-Keto-PGF1α免疫試劑盒 （長沙麗欣生物有限公司， 批號(hào)：201405）；（2）Bio-RADiMark 酶標(biāo)儀 （美國伯樂公司）；（3）無水石膏繃帶、顯微手術(shù)器械、EDTA 管（均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周后開始手術(shù)造模。 參照王兵[4]造模方法：將大鼠左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)脫毛，固定消毒、鋪單后，將大鼠用10%水合氯醛2 mL 腹腔注射麻醉后，采取仰臥位腹腔注射麻醉，沿大鼠左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)縱形切開1.5 cm 的傷口，分離組織顯露股靜脈血管，再使用12.5 mm 全齒蚊氏鉗夾緊(1 格力量)股靜脈血管不同的3 處位置（相隔2 mm）各3 s，鉗夾后，全層關(guān)閉傷口，用髖人字形石膏外固定雙大腿，切口處行石膏開窗；假手術(shù)組不鉗夾股靜脈，余步驟相同，造模后25 h 后拆除石膏。 30 只大鼠造模后，其中27 只切口暴露后，肉眼下可見股靜脈管腔變粗，色澤變深，呈紫黑色，血栓充滿其中，長約4～8 mm，可判斷為成功的深靜脈血栓模型，余3 只未見明顯血栓形成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，10只作為假手術(shù)組（A 組），余下30 只造模。 將造模成功27 只大鼠隨機(jī)分為蒸餾水組（B 組）、低分子肝素鈉組（C 組）、消栓飲組（D 組），每組9 只。

1.2.3 給藥方法 根據(jù)動(dòng)物與人體表面積比值表[5]，計(jì)算出D 組予以消栓飲濃縮藥液18.28 g/（kg·d）灌胃，約為2.48 mL；A 組與B 組予以等體積蒸餾水灌胃；C 組以低分子肝素鈉注射液， 每支原液體積0.4 mL(4 250 IUaXa)，用生理鹽水稀釋為20 mL，每次按366.43 IU/（kg·d)，經(jīng)腹壁皮下注射給藥。 給藥時(shí)間從造模后第2 天開始，均為1 次/d，持續(xù)用藥7 d。

1.2.4 指標(biāo)檢測 在給藥治療7 d 后采用斷尾取血法取血[6]，取血1.0 mL 于EDTA 管中，離心20 min（2 000～3 000 轉(zhuǎn)/min)分離血漿，采用酶聯(lián)免疫法測定TXB2及6-Keto-PGF1α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“±s”表示；以正態(tài)性分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，采用方差分析進(jìn)行組間比較，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況

A 組大鼠可見精神狀態(tài)較好，毛色純白光滑，四肢活動(dòng)靈活，飲食正常。 造模后各組DVT 大鼠均精神欠佳，呼吸加快，左足腫脹、肢端皮膚顏色青紫，患肢活動(dòng)減少， 皮毛欠光滑。 給藥7 d 后，C、D 組較B組的大鼠狀態(tài)可見好轉(zhuǎn)，食欲增加，后肢的血運(yùn)明顯改善，患肢活動(dòng)靈活。 以上提示消栓飲能改善DVT大鼠的一般狀態(tài)和局部血循環(huán)。

2.2 各組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 表達(dá)水平比較

實(shí)施了造模手術(shù)后，B、C、D 各組大鼠血漿中TXB2含量較A 組均有明顯增加，6-Keto-PGF1α表達(dá)則明顯下降(P＜0.01)。 用藥7 d 后與同組用藥前比較，經(jīng)治療的C 組和D 組血漿中TXB2含量及TXB2/6-Keto-PGF1α明顯下降(P＜0.05)， 而6-Keto-PGF1α含量有所增高(P＜0.05)；與7 d 后B 組比較，C 組和D 組 血 漿 中TXB2含 量 及TXB2/6-Keto-PGF1α明 顯降低(P＜0.01)，6-Keto-PGF1α含量有所增高(P＜0.05)；C 組 與D 組 比 較，TXB2、6-Keto-PGF1α差 異 無 統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 表達(dá)水平比較 （±s）

注：與A 組比較△△P＜0.01；與同組用藥前比較○P＜0.05；與同時(shí)間點(diǎn)B 組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組n 10 9 9 9 TXB2(ng/L)用藥前 用藥7 d 后343.9±10.5 346.4±11.6 510.7±18.7△△ 489.9±17.7△△507.7±20.6△△ 420.3±21.6○**509.3±17.3△△ 424.5±27.9○**6-Keto-PGF1α(ng/L)用藥前 用藥7 d 后164.3±14.7 165.9±15.4 112.7±15.2△△ 127.5±15.6△△111.6±14.6△△ 142.7±11.8○*110.2±12.6△△ 144.6±12.6○*TXB2/6-Keto-PGF1α用藥前 用藥7 d 后2.1±0.2 2.1±0.2 4.6±0.5△△ 3.9±0.4△△4.6±0.6△△ 3.0±0.3○**4.7±0.6△△ 3.0±0.4○**

3 討論

近年來，DVT 的防治備受關(guān)注。 血流緩慢、血管內(nèi)膜損傷、血液高凝狀態(tài)是學(xué)界公認(rèn)的DVT 產(chǎn)生的高危因素，而血管內(nèi)膜的損傷被認(rèn)為是最主要的因素。 本實(shí)驗(yàn)造模法，利用蚊氏鉗直接鉗夾大鼠分離后的左側(cè)股靜脈，固定制動(dòng)，模擬臨床手術(shù)時(shí)DVT形成的部分條件，建立急性創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓形成的大鼠模型，可以較好地反映骨科臨床肢體創(chuàng)傷固定后形成DVT 的病理變化過程。

前列環(huán)素（PGI2）主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可舒張血管、抑制血小板黏附和凝集，抵抗血栓的形成。 血栓素A2（TXA2）主要由血小板產(chǎn)生，具有收縮血管和促血小板聚集的作用。 兩者在正常生理狀態(tài)下保持動(dòng)態(tài)平衡，相互拮抗、相互協(xié)調(diào)，共同維持血管收縮性和血小板正常功能，使凝血狀態(tài)維持平衡。PGI2和TXA2極不穩(wěn)定，生成后便轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1α和TXB2，因此可通過檢測6-Keto-PGF1α和TXB2反映PGI2和TXA2的變化[7-8]。 臨床報(bào)道，DVT 病人存在著的TXA2/PGI2平衡失調(diào)[7]，因此研究藥物對兩者平衡的影響，在防治DVT 方面有著重要的意義。

下肢深靜脈血栓形成可歸類為中醫(yī)學(xué)中“脈痹”或“腫脹”等范疇，古籍中的相關(guān)記載頗多。 王勇教授認(rèn)為，此病主要由外傷、久臥、產(chǎn)后等病因致氣血逆亂，瘀血阻滯脈絡(luò)，營血回流不暢，水津外溢，聚而為濕，流注下肢發(fā)為腫脹；確定了以益氣養(yǎng)血、活血化瘀為主，佐以利濕消腫的治療原則，擬方消栓飲取得較好的臨床療效。 方中重用黃芪為君藥，甘溫益氣，使氣旺以助血行；芍藥與桂枝配伍，養(yǎng)血和營，溫經(jīng)通痹；丹參、當(dāng)歸尾、牛膝等祛瘀通脈，補(bǔ)血活血；茯苓、豬苓、澤瀉等利水滲濕；陳皮、枳殼等行氣消脹。 全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，使氣血生化有源，氣行瘀化；水濕清利有常，脈通水行。

低分子肝素鈉具有劑量單一、療效肯定、用藥安全的優(yōu)點(diǎn)，是目前國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的預(yù)防DVT 的首選藥物[10-11]，故本研究將其作為陽性對照藥物，意在通過對比揭示消栓飲對模型大鼠DVT 形成的影響機(jī)制。 從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用藥前各組的TXB2值明顯高于A 組，這說明靜脈血栓形成時(shí)，血液中TXB2水平會(huì)迅速增高。 一周后，B 組的TXB2水平略有下降，推測其有自愈傾向。 而D 組用藥后的TXB2值又顯著低于B 組（P＜0.05），與C 組比較無明顯差異（P＜0.05），說明通過消栓飲治療可以明顯地降低血液中TXB2的含量，使其更加趨于正常。同樣，血栓形成后6-Keto-PGF1α值明顯降低，通過消栓飲和低分子肝素鈉的治療可以升高血液中6-Keto-PGF1α含量。

本次研究結(jié)果顯示，造模后TXB2升高而6-Keto-PGF1α降低，使TXB2/6-Keto-PGF1α明顯高于正常組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。 這表明在靜脈血栓形成過程中以TXA2的縮血管、血小板聚集作用為主。 經(jīng)消栓飲治療后TXB2/6-Keto-PGF1α趨向正常， 表示消栓飲治療能有效地改善TXA2/PGI2平衡失調(diào)， 這時(shí)以PGI2為主的舒張血管、抑制血小板黏附和凝集作用為主，從而加速血栓的溶解和吸收，并防止新的血栓形成，其作用機(jī)制可能與低分子肝素鈉相似。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測， 血液中PGI2/TXA2平衡失調(diào)是引起DVT 的基礎(chǔ)之一。 因此， 對于骨科術(shù)后及DVT 患者，在常規(guī)檢測的基礎(chǔ)上進(jìn)行血漿TXB2、6-K-PGF1α測定， 對預(yù)測 DVT 發(fā)生及觀察藥物對DVT 的治療作用有重要意義。

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