電針對頸椎病模型大鼠椎間盤細胞Wnt1、GSK-3β蛋白的影響

黃萍萍，廖 軍*，鄭春水，鄭佳璇，張 樂，謝巧瑜

（福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州350122）

頸椎病是臨床常見多發病，屬中醫學“痹癥”、“項強”、“頸間痛”、“眩暈”等范疇[1-2]。 近年來，大量的研究顯示了椎間盤細胞的衰老和凋亡是其組織退變過程中的一個非常重要的因素， 然而退變的椎間盤組織中細胞凋亡的確切病因及病理生理機制目前仍不十分清楚[3]。 最近的研究揭示，Wnt/β-catenin 信號轉導通路在椎間盤退變以及維持椎間盤細胞外基質內穩定中起著重要的作用，參與著細胞生長、增殖、分化、凋亡等廣泛的生物學過程[4]，成為頸椎間盤退化治療的靶點之一。 Wnt1 是Wnt信號通路中關鍵的成員之一，作為Wnt 信號通路的始動因子而發揮作用；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）則作為Wnt 信號通路的抑制因子發揮作用。 本文通過觀察電針對頸椎病模型大鼠椎間盤細胞經典的Wnt 信號轉導通路中關鍵調節因子Wnt1、GSK-3β 表達的影響，探討電針“大椎穴”對頸椎間盤退變調控的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

SPF 級SD 大鼠40 只，體質量（180±20）g，雌雄各半， 由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，清潔級， 合格證編號：2007000507918， 許可證號：SCXK(滬)2007-0005。 通過隨機分為空白組10 只，造模組30 只， 造模成功后隨機分為模型組、 電針組、美洛昔康組，每組各10 只。 由我校實驗動物中心飼養，許可證號：SYXK(閩)2005-0004。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

美洛昔康片 （上海勃林格殷格翰藥業有限公司， 批號：H20020217）；HANS-100 型韓氏電針儀（石家莊福賽醫療器械有限公司）； 超低溫冰箱（SANYO 公司）；水平搖床（上海琪特公司）；Trans-Blot 轉印槽（Bio-Rad 公司）； 電泳儀（Bio-Rad 公司）； 垂直電泳槽 （Bio-Rad 公司）； 凝膠成像系統（Bio-Rad 公司）；DYY-6B 型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）； 一抗 （Wnt1，Gsk-3β， 美國CST 公司）；二抗（山羊抗兔IgG，Beyotim TECHCO，Ltd）。

1.3 方法

1.3.1 動物造模 參考王擁軍等[5]的方法建立動靜力失衡性頸椎間盤退變大鼠模型，將大鼠仰臥固定手術臺上，2%戊巴比妥鈉 （40 mg/kg） 腹腔注射麻醉，麻醉起效后，予頸背備皮，碘伏消毒，取大鼠頸背部正中縱向切口， 切開皮膚及皮下組織， 長約2 cm，切開深筋膜暴露頸部的肌肉層，先切斷淺肌群，再橫向切斷深群頸夾肌和頭、頸和寰最長肌，完全切除頸髂肋肌與頭半棘肌， 最后切除了C2～C7的棘上和棘間韌帶，逐層縫合。 手術結束后，動物放置于室溫(24 ℃)的環境下蘇醒，正常飼養3個月。 空白組僅切開皮膚和皮下組織后就直接皮膚縫合， 同等條件飼養。 本實驗通過電鏡檢測對比造模前后大鼠軟骨細胞結構的變化來判斷造模是否成功， 前期研究結果顯示造模后的大鼠軟骨細胞出現了部分凋亡或變性，與空白組相比細胞表面的微絨毛樣凸起變少，細胞外基質中的膠原纖維也發生了減少， 且排列無序，細胞核內出現了明顯的凋亡性改變，可見染色質固縮[6]。前期研究還提示在TUNEL 染色中，模型大鼠椎間盤纖維環細胞的細胞凋亡明顯高于空白組[7-8]。

1.3.2 實驗干預 （1）電針組：造模3個月后，用自制的固定夾將大鼠固定后，定位取穴參照《中國獸醫針灸學》、《實驗針灸學》 并結合動物比較學方法進行定位，選取大鼠“大椎穴”（第7 頸椎與第1 胸椎之間背部正中）[9]，消毒施術部位，用華佗牌的針灸針進行針刺（Φ15×0.3 mm）， 針刺深度5 mm 左右，選用韓氏電針儀，將電流輸入的負極接在大椎穴，在大鼠右耳后針刺與正極連接，刺激參數選用了疏密波、頻率2/100 HZ、電壓2-5 V、電流1 mA，以針柄輕微的抖動為度，在適當時候可以增加刺激強度，通電25 min，1 次/d，1個療程為14 d，療程間休息2 d，共治療2個療程。 （2）美洛昔康組：造模3個月后即給予美洛昔康片灌胃治療，1 次/d，灌胃劑量按“動物體表面積比率換算等劑量法”[7]，折算成人的等量劑量約為0.787 8 mg/kg，治療療程同電針組。 （3）空白組、模型組：均只作固定而不做其他任何處理，時間及療程與電針組同。

1.4 標本采集

干預結束后次日， 給大鼠腹腔注射致死量的10% 水合氯醛致死，在4 倍手術顯微鏡下快速的沿上、 下軟骨終板與椎體的交界面切下C2-C7的椎間盤，分離出纖維環，將其裝入無菌凍存管后迅速放入液氮罐內，然后置于-80 ℃的冰箱凍存備用。

1.5 指標檢測

免疫印跡法（Western blot）檢測頸椎間盤纖維環細胞Wnt1、GSK-3β 蛋白表達水平： 將-80 ℃頸椎間盤組織取出， 加入液氮快速研磨后予RIPA 蛋白裂解液提取組織中的蛋白，12 000 r/min， 離心20 min（4 ℃），棄沉淀，BCA 法測定上清中蛋白濃度；配制SDS-PAGE 膠；80 V 的恒壓電泳至濃縮膠與分離膠交界處， 調電壓到100 V， 恒壓80 V 轉膜50 min，緩沖液TBST 洗（2 min×1 次），5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜30 min；加入一抗，稀釋比例1∶2 000，4 ℃冰箱內搖床反應過夜， 一抗結束后在室溫下用TBST 搖床上水洗脫色 （10 min×3 次），TBS 洗（10 min×1 次）；洗膜后按照1∶2 000 的比例用稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗的封閉液中室溫孵育2 h， 室溫下TBST 搖床上水洗脫色（10 min×3 次），再用TBS 洗（10 min×1 次）；洗膜后采用ECL 化學發光法、顯影、定影后，凝膠成像及分析系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。 Wnt1、GSK-3β 蛋白相對含量用GAPDH 作為內參。

1.6 統計學分析

數據統計采用SPSS 18.0 軟件統計系統進行處理，各組所有數據均以“±s”表示。先行正態檢驗，符合正態檢驗的采用單因素方差進行分析，不符合正態檢驗的采用了多組樣本秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

分析結果表明， 模型組大鼠椎間盤中Wnt1、GSK-3β 蛋白表達與空白組比較相對減少， 差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，電針組與美洛昔康組中Wnt1、GSK-3β 蛋白表達顯著升高， 差異有統計學意義(P＜0.05)，結果見表1、圖1。

表1 各組大鼠頸椎間盤纖維環細胞Wnt1、GSK-3β蛋白表達結果 （n=10，±s）

表1 各組大鼠頸椎間盤纖維環細胞Wnt1、GSK-3β蛋白表達結果 （n=10，±s）

注：與空白組比較*P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05。

組 別空白組模型組電針組美洛昔康組Wnt1 蛋白1.070±0.130 0.879±0.104*1.024±0.142△1.040±0.128△GSK-3β 蛋白0.733±0.120 0.557±0.113*0.690±0.097△0.687±0.123△

3 討論

椎間盤退變 (intervertebral disc degeneration，IVDD)是隨著年齡增長且與多種因素有關，使得椎間盤在組織、 功能和代謝上發生改變， 導致椎間盤變硬以及強度下降。 研究顯示IVDD 與椎間盤組織細胞凋亡有關， 椎間盤細胞凋亡以及因凋亡而導致的基質代謝失調， 是使椎間盤發生退變的重要因素[10]。 因此，延緩或抑制細胞凋亡是防止頸IVDD 的有效途徑之一。

最近的研究揭示了Wnt/β-catenin 信號通路是一個復雜的蛋白質作用通路，不僅在調節椎間盤合成代謝因子和分解代謝因子的平衡中發揮了重要作用，而且對椎間盤細胞增殖和老化過程的影響比對椎間盤細胞外基質代謝的作用更大，在進化上是一種高度保守的信號轉導通路，能夠調節椎間盤細胞的自我更新，參與細胞凋亡、生長、增殖、分化以及代謝等廣泛的生物學過程， 與調控基因表達、細胞黏附、細胞行為和細胞極性均有關[11]，以不同的基質調控著諸多的生命過程，這些功能對調控椎間盤退變有生物學意義。其作用機制是：Wnt 蛋白作用于細胞膜上的受體， 信號傳入細胞后，Wnt 信號抑制GSK-3β，中斷β-連環蛋白(β-catenin)的降解，細胞質內游離的β-catenin 含量增加，異位進入細胞核，作用于T 細胞因子/淋巴樣增強因子(Tcell factor/lymphocyte enhancerfactor，TCG/LEF)，形成轉錄復合物，激活Wnt 信號途徑中的靶基因，調控細胞的凋亡、生長和分化[12]。

Wnt1 是Wnt 信號通路中的關鍵成員之一，作為Wnt 信號通路的始動因子而發揮作用。Wnt1 蛋白高表達可激活Wnt 通路，引起胞內βcatenin 的 積 累， 同 時GSK-3β 積 累 并 進 入 細 胞核，激活下游靶基因轉錄，繼而引起下游一系列基因的改變而發揮多種生物學效應[13]，其通過激活Wnt/β-catenin 經典通路來抑制細胞凋亡，是控制細胞生長、增殖的關鍵分泌信號分子，傳遞細胞間相互調控信息。 本研究應用Western blot 法檢測Wnt1 蛋白在IVDD 中的表達水平的結果顯示Wnt1 蛋白高表達，說明電針“大椎穴”可能就是通過促使Wnt1 蛋白高表達從而激活Wnt/β-catenin 經典通路來抑制細胞凋亡的。

GSK-3 是絲氨酸/蘇氨酸類激酶中的一種，研究發現有GSK-3α 與GSK-3β 兩個亞型， 其中GSK-3β 的生物學功能較復雜，是真核生物細胞重要信號通路的關鍵酶， 廣泛參與機體的多種重要生命活動。 研究表明，GSK-3β 是細胞內Wnt/β-catenin、核因子-JB(nuclear factor-JB，NF-JB)等眾多信號通路的主要調控酶，通過對下游核轉錄因子的影響參與細胞增殖和凋亡的調控[14]。國外也有研究認為GSK-3β 在Wnt 信號通路中起到開關的作用， 是決定βcatenin 磷酸化的關鍵激酶[15]。 研究顯示，GSK-3β 的調節是雙向的，當扮演“正向調控”的角色被抑制時，不可避免阻斷了其“負向調控”的功能，使得Wnt/β-catenin 信號通路被激活[16]。 在正常情況下，Wnt 處于失活狀態， 酪蛋白激酶1α 和GSK-3β 依次磷酸化β-catenin，蛋白酶體降解p-β-catenin，胞質中的β-catenin 始終維持較低的濃度水平， 與此同時，該降解物上的GSK-3β 能將磷酸基團加到βcatenin 氨基端的絲氨酸/蘇氨酸的殘基上使βcatenin 發生磷酸化； 磷酸化后的β-catenin 通過泛素化途徑被蛋白酶體降解， 最終導致胞內的βcatenin 總體水平明顯降低，從而抑制椎間盤退行性病變的進程[17]。

“大椎穴”為督脈上的主要穴位，位于后正中線上，第七頸椎棘突下凹陷中，又名“百勞”、“上杼”，為“手足三陽、督脈之會”穴，《針灸大成》載“大椎穴主肺脹脅滿，嘔吐上氣，五勞七傷，乏力，溫虐咳虐，氣注背膊拘急，頸項強不得回顧，風勞食氣，骨熱，前板齒燥。 ”《難經·二十八難》曰督脈“并于脊里，上至風府，入屬于腦”，依據“腧穴所在，主治所在”之理論，針刺“大椎穴”可溫陽解痙，調節經絡氣血運行，是治療頸椎病的主要穴位。

本研究結果顯示， 電針組大鼠頸椎間盤纖維環細胞的Wnt 通路中Wnt1、GSK-3β 蛋白高表達，說明電針“大椎穴” 抑制頸椎病模型大鼠椎間盤細胞凋亡，其機制很有可能與電針影響了Wnt/β-catenin 信號通路中的關鍵調節因子Wnt1、GSK-3β 蛋白表達有關， 可能是調控頸椎間盤退變的的重要分子機制之一，但其具體激活通路尚待進一步研究。 本實驗結果從生物分子學角度闡明了電針通過抑制頸椎間盤纖維環細胞凋亡從而達到治療椎間盤退變性頸椎病的作用。 因此，通過干預頸椎間盤細胞凋亡途徑中關鍵因子的表達來延緩或逆轉椎間盤細胞凋亡， 可能成為治療頸椎間盤退變的新思路。

[1]蔣學余，付漫娣.針刺頸椎病穴治療椎動脈型頸椎病的臨床觀察[J].湖南中醫藥大學學報，2012，32（9）：70-73.

[2]張 健.電針結合牽引治療神經根型頸椎病52 例[J].中醫藥導報，2012，18（6）：62-63.

[3]Le Maitre CL，Freemont AJ，Hoyland JA. Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs：a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration [J]. Arthritis Res Ther，2007，9(3)：R45.

[4]Hiyama A，Sakai D，Risbud MV，et a1. Enhancement of intervertebral disc cell senescence by WNT/β-catenin signaling-induced matrix metalloproteinase expression [J]. Arthritis Rheum，2010，62(10)：3 036-3 047.

[5]王擁軍，施 杞，沈培芝，等. 動靜力失衡性大鼠頸椎間盤退變模型的動態觀察[J].中國中西醫結合雜志，2001，21(3)：199-202.

[6]鄭佳璇. 電針對大鼠頸椎病模型軟骨細胞凋亡及PI3K/Akt 的影響[D].福州：福建中醫藥大學，2014.

[7]柯玫瑰，廖 軍，徐 騰.電針大椎穴對大鼠頸椎病模型纖維環細胞FAK 蛋白表達的影響[J]. 福建中醫藥大學學報，2013，23(4)：25-28.

[8]Liao J，Ke M，Xu T，et al. Electroacupuncture inhibits apoptosis in annulus fibrosis cells through suppression of the mitochondria-dependent pathway in a rat model of cervical intervertebral disc degradation [J]. Genet Mol Biol，2012，35(3)：686-692.

[9]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫藥出版社，2003：324，334.

[10]Li X，Wu FR，Xu RS，et al. Acid-sensing ion channel la-mediated calcium influx regulates apoptosis of endplate chondrocytes in intervertebral discs [J]. Expert Opin Ther Targets，2014，18(1)：1-14.

[11]Hiyama A，Sakai D，Tanaka M，et a1. The relationship between the Wnt/β-catenin and TGF-β/BMP signals in the intervertebral disc cell [J]. J Cell Physiol，2011，226(5)：1 139-1 148.

[12]Duan，JZ，Gherghe，C，Liu，DX，et a1. Wnt1/βcatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair [J]. EMBO Journal，2011，31(2)：429-442.

[13]李海英，張 力，潘歡樂，等. Wnt 信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用[J].中國病理生理雜志，2012，28(9)：1 623-1 626.

[14]劉 坤，鐘雪云，羅 楓，等.GSK-3β 抑制劑對結腸癌SW480 細胞增殖和凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志，2011，27 (1)：97-101.

[15]Jope RS. Lithium and GSK-3：one inhibitor，two inhibitory actions，multiple outcomes [J]. Trends Pharmacol Sci，2003，24(9)：441-443.

[16]陶 麗，盛曉潑，劉玉萍，等. GSK-3β 活性調節與腫瘤治療[J].中國藥理學通報，2014，30(6)：741-744.

[17]McManus EJ，Sakamoto K，Armit LJ，et a1. Role that phosphorylation of GSK3 plays in insulin and Wnt signalling defined by knockin analysis [J]. EMBO J，2005，24(8)：1 571-1 583.