參苓白術散對胃癌IV期患者外周血CD4+CD25+Tregs的影響

周 波，戴飛躍

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率高居癌癥死因的第2 位［1］。 然而人們卻不太注重胃癌的早期篩選，當發現胃癌時患者往往處于臨床IV 期。對于該部分患者，美國國立綜合癌癥網絡公布的胃癌NCCN 指南建議其接受多學科參與的綜合性治療，而中醫藥是腫瘤綜合治療不可或缺的部分。 參苓白術散是治療晚期胃癌脾胃氣虛型患者的有效方劑，它通過健脾益胃增強脾胃功能，提升整體抗癌機能［2］。但其具體的作用機制仍未得到闡明。近年來，CD4+CD25+Tregs 介導的腫瘤免疫逃逸機制在胃癌中得到證實［3］。因此，本研究通過前瞻性臨床應用基礎研究， 探明參苓白術散能否對胃癌IV 期患者外周血CD4+CD25+Tregs 和相關細胞因子產生影響，闡述其療效機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年3月至2013年9月住院治療的40 例經胃鏡或手術病理證實的胃癌患者。 參照2010年國際抗癌聯盟／美國癌癥聯合委員會（UICC／AJCC）分期標準進行胃癌TNM 分期，均為臨床IV 期。 隨機分為2 組。 對照組：男12 例，女8例；年齡42～66 歲，平均（54.0±3.7）歲；分化程度：低分化13 例，中分化7 例；腫瘤部位：賁門及胃底3例，胃體2 例，幽門及胃竇15 例；觀察組：男11 例，女9 例；年齡45～70 歲，平均（57.5±4.0）歲；低分化11 例，中分化9 例；賁門及胃底5 例，胃體3 例，幽門及胃竇12 例。 兩組一般資料無統計學差異 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標準

符合胃癌IV 期的診斷及分期標準［4］；符合晚期胃癌脾胃氣虛中醫證候診斷標準［5］；無嚴重的心、肝、腎、腦等臟器功能損害；無急慢性肝炎，無免疫系統疾病，近期未使用免疫抑制劑；對本研究內容知曉，并簽署知情同意書。

1.3 排除標準

未按規定療程服藥者；有嚴重并發癥如重癥感染、胃出血、胃穿孔、胃腸梗阻。

1.4 治療方法

對照組予對癥支持治療，主要采用靜脈營養支持治療：靜脈用氮0.15 g/（kg·d），非蛋白質熱量為28 kcal/kg，并且補充維生素和微量元素等。 觀察組在對癥支持治療的同時予參苓白術散， 方藥組成：人參6 g，白術10 g，茯苓10 g，白扁豆10 g，砂仁10 g， 山藥10 g， 薏苡仁10 g， 桔梗10 g， 蓮子10 g， 甘草3 g。 常規水煎2 次， 每日2 劑， 每劑200 mL（含生藥0.4 g/mL），溫服，共4 周。患者在治療期間忌食生冷油膩、辛辣之品，禁煙酒，停服其他藥物。

1.5 觀察指標及檢測方法

患者治療前及治療后第4 周晨起空腹抽取上肢靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，共3 管。

1.5.1 外周血CD4+CD25+Tregs 含量 采用FCM方法， 流式細胞儀檢測，Cellquest 軟件數據分析，記錄陽性細胞百分率。

1.5.2 Foxp3 mRNA 表達水平 逆轉錄-多聚合酶鏈反應（RT-PCR）紫外分光光度計定量總RNA，調整濃度為：1 μg/μL。 按cDNA 第一鏈反應試劑盒說明采用隨機引物法合成cDNA。用GAPDH 作為內行參照行PCR 定量檢測（Foxp3/GAPDH×1000）。Foxp3引物序 列為： 上游：5’-GCTGGTCGG-GA GAAGAGGAAAA -3’， 下 游：5’ -CAGTATCCCACGGAAATAACCT-3’，擴增長度：433 bp。GAPDH 引物序列為：上游：5’-AACGGATTTGGTATTG-3’，下游：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，擴增長度：208 bp。PCR 參數：94 ℃5 min 變性；94 ℃35 s，52 ℃40 s，71 ℃55 s，38個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物于2%瓊脂糖電泳，電壓60 伏，55 min。 Gel ID凝膠分析系統攝片并測定分析其光密度。 計算各個樣本Foxp3 表達水平。

1.5.3 IL-10、TGF-β1 測定 采用ELISA 雙抗體夾心法，試劑盒由上海恒遠生物技術發展有限公司提供，所有操作嚴格按說明書進行。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 和Foxp3 mRNA 表達水平的比較

觀察組治療后外周血CD4+CD25+Tregs 含量及Foxp3 mRNA 表達較治療前均明顯降低， 差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組治療后各項指標無明顯變化（P＞0.05）。 兩組治療后比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表達水平的比較（n=20，±s）

表1 兩組治療前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表達水平的比較（n=20，±s）

注：與本組治療前比較△P＜0.05；與對照組比較*P＜0.05。 下表同。

組 別觀察組對照組治療前治療后治療前治療后CD4+CD25+Tregs（%）28.87±8.45 10.12±4.32△*28.65±8.61 26.99±9.13 Foxp3 mRNA 4.42±0.43 2.18±0.26△*4.48±0.47 4.36±0.42

2.2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較

觀察組治療后血清IL-10 和TGF-β1 濃度較治療前均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組治療后各項指標無明顯變化（P＞0.05）。 兩組治療后比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較（±s）

表2 兩組治療前后血清IL-10 和TGF-β1 的比較（±s）

組 別觀察組對照組n 20 20治療前治療后治療前治療后IL-10（pg/L）95.74±7.34 70.56±6.77△*91.77±6.45 88.53±6.78 TGF-β1（ng/mL）18.65±3.52 10.33±3.46△*17.67±3.47 16.42±4.20

3 討論

上世紀初，Ehrlich 等提出了腫瘤免疫的概念，隨后Thomas 和Burnet 等又進一步提出了腫瘤的免疫監視理論。 隨著腫瘤免疫研究的深入，學者們逐漸發現T 淋巴細胞和免疫調節細胞的平衡在機體的抗腫瘤免疫作用中發揮著重要作用。 CD4+CD25+Tregs 是一類具有免疫抑制功能的T 淋巴細胞亞群，它可以通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β 發揮免疫負調節抑制腫瘤特異性T 淋巴細胞， 減少T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，使其逃脫免疫系統的監視。 研究表明，胃癌患者外周血中腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 增多， 通過抑制CD4+Th1 和CD8+T 淋巴細胞誘發腫瘤發生免疫逃逸，導致腫瘤的發生發展［6］。 近年來，CD4+CD25+Tregs 是腫瘤免疫治療的新靶點。 本研究發現，參苓白術散干預胃癌IV 期患者后外周血CD4+CD25+Tregs 和相應細胞因子IL-10、TGF-β1 均下降， 這可改善胃癌患者體內腫瘤特異性T 淋巴細胞的抑制狀態， 因此，參苓白術散具有潛在的免疫調節作用。

1995年，Sakaguchi 等率先在小鼠外周血中分離獲得發揮免疫抑制功能的CD4+CD25+Tregs，該群細胞持續表達CD25（IL-2 受體α 鏈），被稱為調節性T細胞。 隨后，Fontenot 等研究小組同時報道X 染色體編碼的Foxp3 轉錄因子(forkhead/ winged helix transcription factor，叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子)特異性表達于CD4+CD25+Tregs，是Tregs 發育、活化、發揮功能的關鍵，可作為特異標志。Foxp3 是目前公認的特異性最強的Tregs 分子標志物［7］。Kryczek I 的研究表明Foxp3 是腫瘤患者和免疫缺陷性疾病患者體內的Tregs 特異性分子標志物［8］。在國內有研究表明胃癌組織中Foxp3+Tregs 的浸潤是胃癌術后的獨立危險因素，Foxp3+Tregs 高表達者預后很差［9］。 中藥復方參苓白術散具有多種藥理效應的物質成分，能對腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 起到干預作用。 本研究發現， 參苓白術散干預胃癌IV 期患者后外周血單個核細胞Foxp3 mRNA 減少，這很可能是其降低外周血CD4+CD25+Tregs 的原因。

中醫學家臨床發現晚期胃癌患者往往表現為正虛邪實的病理狀態，以正虛為本，依據精氣奪則虛，治法往往偏“補”。 臨床上胃癌IV 期患者通過整體觀和辨證施治運用參苓白術散治療后中醫證候、體力狀態、生活質量及近期生存均有效改善，但是其治療的科學內涵仍未得到闡述。 目前，腫瘤免疫逃逸機制和腫瘤的免疫治療一直是腫瘤基礎和臨床研究的重點。 很多中藥和中藥復方（補益作用）的有效組分對機體的免疫系統具有調節作用。 本研究顯示，健脾益氣之參苓白術散能對胃癌患者腫瘤特異性CD4+CD25+Tregs 和其分泌的抑制性細胞因子IL-10、TGF-β1 起到抑制作用， 并能降低CD4+CD25+Tregs 的特征性標志Foxp3 的表達。 缺少核轉錄因子Foxp3，外周血CD4+CD25+Tregs 減少。 本研究初步闡明了參苓白術散扶正抗癌的免疫調節機制，但未探討其量效關系、時效關系以及影響Foxp3表達的上游機制仍未清晰，有待進一步研究。

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