馬錢子堿透皮貼劑鎮痛實驗研究及對大鼠腦啡肽含量的影響

崔 姣，許惠琴*，陶玉菡

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410005；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京210046）

馬錢子為馬錢科植物馬錢子(Strychnos nuxvomica L.)的干燥成熟種子，具有通絡止痛、散結消腫的功效。 近年來， 馬錢子廣泛應用于各種腫瘤的臨床治療， 具有較好的抗癌和癌性疼痛的作用， 成為抗腫瘤中藥研究的一個熱點。 馬錢子主要活性成分是吲哚類生物堿， 士的寧和馬錢子堿是最主要的兩種生物堿， 二者含量占馬錢子總生物堿的70%～80%，其中馬錢子堿是馬錢子鎮痛的主要活性成分[1]。 但是馬錢子毒性較大，其治療劑量和中毒劑量接近。

本實驗室前期試驗已經表明馬錢子堿經皮給藥后的絕對生物利用度為32.8%， 平均滯留時間（MRT）是靜脈注射的8 倍，經皮給藥途徑可能有利于馬錢子堿的減毒增效[2]，且初步進行了小鼠醋酸扭體實驗的研究[3]。 本試驗在此基礎上研究馬錢子堿透皮吸收后的鎮痛作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 CL 級ICR 小鼠50 只， 許可證號：SCXK （蘇）2008-0010；SD 大鼠100 只， 許可證號：SCXK(蘇)2007-0001，由揚州大學比較醫學中心提供。

1.1.2 主要藥物 馬錢子堿，日本和光純藥工業株式會社，批號：059-17；芬太尼透皮貼劑（西安楊森制藥有限公司）。

1.1.3 主要試劑 冰醋酸： 上海化學試劑有限公司，批號：03081014。 5-HT，由Sigma 公司提供，批號：29H7011。磷酸鹽緩沖液(PBS)：中杉金橋。氯化鈉注射液，山東華魯制藥有限公司，批號：B08110807。氫氧化鈉(NaOH)， 天津金匯太亞化學試劑有限公司，批號：20090420。

1.1.4 主要儀器 UniCel DxI800（BECKMAN COULTER）；5415R 低溫高速離心機 （基因有限公司）；YLS-9A 生理藥理電子刺激儀 （淮北正華生物儀器設備有限公司）；YLS 壓痛儀（濟南益延科技發展有限公司）；TB-04 型實驗用精密涂布機（上海鍇凱科技貿易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 馬錢子堿透皮貼劑的制備 首先采用冷凍干燥法制備馬錢子堿羥丙基-β-環糊精包合物，再在骨架材料溶液中加入馬錢子堿包合物，采用精密涂布機涂布在背襯膜上，切割成型。1 cm2透皮貼劑含24 mg 馬錢子堿， 分別切割成大約0.05、0.1、0.2 cm2用于小鼠藥效學實驗， 切割成大約0.25、0.5、1 cm2用于大鼠藥效學實驗。

1.2.2 測定馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 取健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，體質量18～22 g，隨機均分為5 組：（1）空白對照組（下稱A 組）：空白基質；（2）芬太尼組（下稱B 組）：40 mg/kg；（3）馬錢子堿透皮貼劑小劑量組（下稱C組）：60 mg/kg；（4）馬錢子堿透皮貼劑中劑量組（下稱D 組）：120 mg/kg；（5）馬錢子堿透皮貼劑大劑量組（下稱E 組）：240 mg/kg。 各組小鼠腹部剃毛器剃毛后，給予藥物，用膠帶固定。 每只小鼠給藥1 次。

實驗用生理實驗多用儀進行，給藥前將小鼠放在導電銅絲板上，通電后，調節電壓輸出鈕，使電壓由低到高，以秒表記錄時間，當小鼠出現第一聲尖叫時立即斷電， 此段時間為小鼠用藥前的痛閾值，固定此電壓值不變，給藥后在不同時間點（20 min及1、2、4、8、10 h） 以同等電壓強度進行自身對照，刺激時間1 s，頻率為8 Hz，電壓保持不變。 用藥前痛閾值低于15 s 者剔除不用， 用藥后痛閾值超過45 s 即可切斷刺激，痛閾以45 s 計。

1.2.3 測定馬錢子堿透皮貼劑對大鼠5-HT 致痛作用的影響 取健康SD 大鼠50 只， 雄性， 體質量180～200 g， 隨機均分為5 組：（1）A 組： 空白基質；（2）B 組： 20 mg/kg；（3）C 組：30 mg/kg；（4）D 組：60 mg/kg；（5）E 組：120 mg/kg。 各組大鼠腹部剃毛，給予藥物后，用膠帶固定。 每只大鼠給藥1 次。

各組給藥前用壓足法測定大鼠右后足基礎痛閾值(取3 次平均值，法碼值小于50 g 或大于750 g棄之不用)。給藥30 min 后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1%～2% 5-HT 0.1 mL 致炎，測量大鼠給藥后1、2、4、8 h 致炎足的痛閾。

鎮痛率=[(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)／給藥前痛閾值]×100%

1.2.4 測定馬錢子堿透皮貼劑對大鼠大腦功能區腦啡肽含量的影響 取健康SD 大鼠50 只，雌雄各半，體質量180～200 g，分組及給藥方法同“1.2.3”。每只大鼠給藥1 次。

大鼠禁食過夜，次晨給藥后30 min，在安靜狀態下快速斷頭取腦，置煮沸生理鹽水中3 min。取出后依照圖譜取腦干、下丘腦、丘腦與紋狀體。 各腦區分別稱質量后置3 mL 的1.0 mol/L 鹽酸勻漿器中制成勻漿， 再加0.3 mL 的1.0 mol/L NaOH 及0.7 mL 的0.5 mol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液，最后加PBS 液，補足至5 mL 后離心20 min，取上清液在放免測定儀上作放射免疫分析（RIA）測定，依照標準曲線將實驗結果換算成每克腦組織中的腦啡肽含量(pg)。

1.3 統計學分析

所有數據使用SPSS 16.0 軟件進行處理。 實驗數據用“±s”表示，組間差異顯著性判斷采用方差分析，組間比較采用LSD 檢驗。

2 結果

2.1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響

實驗結果顯示：馬錢子堿透皮貼劑3個劑量組在4、8、10 h 3個時間點能提高小鼠痛閾值百分率，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。 見表1。

2.2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響

實驗結果顯示：E 組在1、2、4、8 h 4個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率，與A 組比較差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；D 組在2、4、8 h 3個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率， 與A 組比較差異有統計學意義 （P＜0.01，P＜0.05）。 C 組在2、4 h 2個時間點能提高致炎大鼠足壓痛的痛閾值百分率，與A 組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。 見表2。

表1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 （±s，n=10，s）

表1 馬錢子堿透皮貼劑對電刺激致痛小鼠痛閾值的影響 （±s，n=10，s）

注：與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01。 下表同。

組別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—40 60 120 240 20 min 11.6±7.4 12.9±12.3 11.2±4.5 13.1±6.1 16.5±14.3 1 h 12.4±8.7 24.6±17.2 14.9±6.4 13.8±5.3 24.1±16.0 2 h 12.7±10.5 27.7±17.2*23.5±11.2 21.5±8.9 26.6±16.8 4 h 10.6±8.8 29.1±16.9*25.1±14.0*30.4±11.9**37.8±13.9**8 h 13.3±8.9 33.8±14.3**27.7±14.4*31.4±12.5**33.5±16.3**10 h 18.2±8.9 33.1±16.2*29.9±11.3*29.8±13.9*36.9±13.4**測量時間點

表2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響（鎮痛率） （±s，n=10，%）

表2 馬錢子堿透皮貼劑對5-HT 致炎后大鼠足壓痛的影響（鎮痛率） （±s，n=10，%）

組 別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—20 30 60 120 1 h 15.7±68 46.3±39 66.6±63 185.2±156 172.4±135*2 h 21.1±51 87.7±81*181.0±137**200.0±181**271.7±190**4 h 32.9±51 178.5±109**170.1±117**200.2±191**236.8±175**8 h 24.1±59 97.5±95*86.5±63 146.2±127*135.6±110*測量時間點

2.3 馬錢子堿透皮貼劑對大鼠功能區腦啡肽含量的影響

實驗結果顯示：D 組、E 組能提高大鼠大腦功能區腦啡肽的含量，與A 組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 馬錢子堿透皮貼劑對各組大鼠功能區腦啡肽含量的影響 （±s，n=10）

表3 馬錢子堿透皮貼劑對各組大鼠功能區腦啡肽含量的影響 （±s，n=10）

組別A 組B 組C 組D 組E 組劑量（mg/kg）—20 30 60 120腦啡肽含量（pg/g）9.85±3.27 12.27±3.04 12.62±4.47 15.37±3.57**16.49±1.99**

3 討論

經皮途徑給藥可能是避免馬錢子堿毒性反應的有效手段。 馬錢子堿同時具有中樞和外周鎮痛作用[1]，經皮給藥途徑降低中樞神經毒性的同時可能降低了其中樞鎮痛作用，但對外周鎮痛作用（如麻痹神經末梢）影響可能不大。 前期實驗通過小鼠醋酸扭體法表明馬錢子堿貼劑透皮吸收完全，能對抗醋酸引起的小鼠扭體反應[3]。 本實驗結果表明馬錢子堿透皮貼劑能提高小鼠電刺激致痛的痛閾值和5-HT 致炎大鼠的鎮痛率。 與芬太尼組比較，馬錢子堿組能發揮與其等同的藥效。

腦啡肽是神經內分泌系統產生的一種多肽激素，屬內源性阿片樣物質。 內源性阿片肽是體內具有阿片樣活性的一類物質，通過作用于不同部位的各種類型的阿片受體，發揮復雜而又多樣的生理調節作用。 大腦功能區的腦啡肽是腦內含量最高的內源性神經肽，具有廣泛的鎮痛作用[4]。 芬太尼為阿片受體激動劑，屬強效麻醉性鎮痛藥，治療中度到重度慢性疼痛以及那些只能依靠阿片樣鎮痛藥治療的難消除的疼痛， 但是芬太尼血清的濃度逐漸增加，在12～24 h 內達到穩定，故在給藥30 min 后對腦啡肽的影響不大。 馬錢子中、大劑量組能提高大鼠大腦功能區腦啡肽的含量，提示馬錢子堿的中樞鎮痛作用可能是通過增加腦內神經遞質--腦啡肽發揮鎮痛作用，并且血清的濃度增加較快。

綜上， 馬錢子堿透皮貼劑具有較好的鎮痛作用，吸收比較快，作用時間比較長，減少給藥的頻率，避免了藥物濃度的波動，能起到平穩鎮痛，極大程度上避免了馬錢子的毒性作用。 此外，馬錢子堿透皮貼劑鎮痛作用可能是通過增加大腦功能區腦啡肽的含量，作用于阿片受體，起到中樞鎮痛的作用。

[1]Yin W，Wang TS，Yin F Z，et al. Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnosnux-vomica [J]. J Ethnopharmacol，2003，88(2-3)：205-214.

[2]陳 軍，王立杰，蔡寶昌，等.馬錢子堿經皮給藥后在小鼠體內的藥動學研究[J].中草藥，2010，41(8)：1 350-1 352.

[3]胡 巍，陳 軍，蔡寶昌，等.馬錢子堿經皮給藥的鎮痛作用[J].中華中醫藥學刊，2008，26(2)：385-386.

[4]Braz J，Beaufour C，Coutaux A，et al. Therapeutic efficacy in experimental polyarthritis of viral-driven enkephalin overproduction in sensory neurons [J]. J Neurosci，2001，21(20)：7 881-7 888.