重組IFN-α-IL-18 體外對雞外周血淋巴細胞轉化及核因子κB 的影響①

楊 惠 李銀聚 劉一塵 程相朝 楊丹芳 韓海鋒 金修哲

(河南省動物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學動物疫病與公共衛生重點實驗室，洛陽 471003)

雞干擾素α(Chicken interferon，ChIFN-α)是一種重要的免疫細胞因子，它誘導細胞進入抗病毒狀態，并在禽類抵抗病毒感染及免疫調節中扮演主要角色［1］。ChIFN-α 不影響機體細胞本身的mRNA與核蛋白體的結合，不妨礙宿主細胞的生長［2］。此外，干擾素還具有廣泛的調節功能，參與調節和控制細胞復制、增生及機體免疫系統的激活［3］。雞白細胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是近年發現的一種重要的細胞因子，是細胞因子網絡中的重要成員［4］，具有復雜的生物學功能，能誘導T 細胞增殖、增強IFN-γ 的分泌，對MHC Ⅱ類分子的合成也具有正調節作用［5］。

核因子kappa B(Nuclear factor kappa-B，NFκB)是由Rel/NF-κB 家族的多肽成員組成的一組轉錄因子［6，7］。NF-κB 通常與其抑制蛋白IκB (Inhibitor of NF-κB，IκB)結合，并以非活性狀態貯存于細胞質中［8］;當細胞受到如細菌、細胞因子等刺激后，NF-κB 以活化的形式進入細胞核［9］，和靶基因上的特異DNA 序列結合后，對免疫調節、細胞生長、炎癥、腫瘤生成和凋亡在內的400 多基因的發揮中心性轉錄調節作用［10］。NF-κB 作為轉錄因子，在生命活動中與疾病發生發展中的重要作用已得到廣泛的認同［11］。

為了便于實際工作中實現同時調節抗病毒和免疫增強作用，本實驗將雞的IFN-α-IL-18 基因融合并在畢赤酵母中表達，對表達產物的免疫活性進行檢測，初步研究了雞IFN-α-IL-18 融合蛋白對雞外周血淋巴細胞轉化及NF-κB 表達的影響，為進一步闡明IFN-α-IL-18 融合蛋白的功能及作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 雞胚、菌株、質粒及試劑 SPF 雞胚購于山東省農業科學院家禽研究所;重組酵母菌X-33/pPICZ-IL-18 和質粒pMD-19T-IFN-α［12］為河南科技大學動物疫病與公共安全實驗室提供;工具酶、dNTP 等購自TaKaRa 公司;DNA 回收和質粒純化試劑盒購自上海生工生物科技有限公司;Zeocin、MTT等購自Solarbo 公司;His 小鼠源單克隆抗體及山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天生物科技研究所;Ni-NTA His·Bind resin 購自Merck (Novagen)公司;淋巴細胞分離液、BCA 蛋白定量測定試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;細胞核蛋白提取試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司;雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒購自上海圻明生物技術有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 引物設計 根據GenBank (GU119896.1)設計2 對IFN-α 引 物:P1:CGGAATTCAACCACCTTCGCCC;P2:GGCTCTAGAGCAGTGCGAGTGATAAATGTG(劃線部分分別為EcoRⅠ和XbaⅠ位點);P3:ACGGTACCAACCACCTTCGCCCCCAG;P4:GAAGATCTATTAGTGCGAGTGATAAATGTGAGG(劃線部分分別為KpnⅠ和BglⅡ位點)，由北京六合華大公司合成。

1.3 重組酵母表達質粒pPICZ-IFN-α 和pPICZIFN-α-IL-18 的構建 以質粒pMD-19T-IFN-α 為模板，以P1、P2 為引物，PCR 擴增出帶有EcoRⅠ/XbaⅠ酶切位點的IFN-α 基因片段，經EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切后，與經同樣雙酶切載體質粒pPICZ-αA 作定向連接，構建重組酵母表達質粒pPICZ-IFN-α。

以質粒pMD-19T-IFN-α 為模板，以P3、P4 為引物，PCR 擴增獲得帶有Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切位點的IFN-α 基因片段，經KpnⅠ/Bgl Ⅱ雙酶切后，與KpnⅠ/BamHⅠ切除HN 基因的質粒pBS SK+-HN-IL-18利用BamHⅠ和BglⅡ同裂酶性質連接，構建重組質粒pBS SK+-IFN-α-IL-18。分別對質粒pBS SK+-IFN-α-IL-18 和pPICZ-αA 載體質粒進行KpnⅠ/NotⅠ雙酶切，將獲得的IFN-α-IL-18 融合基因和pPICZ-αA 載體片段相互連接，構建重組酵母表達載體pPICZ-IFN-α-IL-18。

1.4 重組酵母菌的誘導表達和Western blot 檢測 以電轉方法將線性化的重組質粒pPICZ-IFN-α 和pPICZ-IFN-α-IL-18 轉化至畢赤酵母感受態X-33 細胞，經高抗性YPDZ(Zeocin 2 000 μg/ml)篩選，篩選到含有目的基因片段的重組菌X-33/pPICZ-IFN-α和X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18。挑取重組酵母X-33/pPICZ-IFN-α、X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18 和 X-33/pPICZ-IL-18 及對照菌X-33/pPICZ-αA 形成的單個菌落，接種到BMGY 培養液中，30℃，300 r/min，培養至對數生長期，離心棄培養液，沉淀酵母細胞用等體積的BMMY 培養液重懸，27℃～29℃繼續振蕩培養，每24 h 添加甲醇至終濃度為1%，留取不同時間段的培養液上清，在真空濃縮系統中做2 倍濃縮。SDS-PAGE 檢測后，將蛋白條帶電轉移至硝酸纖維素膜(恒流1 mA/cm，3 h)，清洗后以5 %脫脂奶粉封閉，TBST 和TBS 緩沖液漂洗后，加His 小鼠源單克隆抗體37℃作用3 h，加入山羊抗小鼠IgG(H +L)作用1 h，洗滌后加DAB 反應液，于暗處反應10～20 min，至目的條帶清晰時加終止液終止反應。

1.5 重組蛋白的純化及定量 采用Ni 柱純化法，按Ni-NTA His·Bind resin 說明書對重組蛋白進行純化，并用SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的純化效果，濃縮后用BCA 試劑盒測定目的蛋白質含量。分別將純化后的重組蛋白IFN-α-IL-18、IFN-α 和IL-18 調整濃度為1.0 mg/ml。

1.6 表達產物促淋巴細胞轉化 取10 只SPF 雞胚在無菌潔凈孵化器中孵化，從所孵化的雛雞中選取健康的雄性雛雞6 只，飼養至9 日齡，無菌從心臟采血，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。Hank's 液洗滌，2 000 r/min 離心后用含1 %雙抗、10 %胎牛血清的RPMI1640 培養液懸浮，取10 μl 細胞計數，按計數結果將細胞懸液調整細胞密度至5.0 × 107ml-1。對照組加空載體上清200 μl，實驗組加pPICZ-IFN-α-IL-18、pPICZ-IL-18 和pPICZ-IFN-α 各200 μg(200 μl)，37℃，5 %CO2培養箱中培養72 h，分別取培養0、24、48、72 h 的細胞，作下一步檢測。

1.7 促淋巴細胞轉化活性檢測 采用MTT 法，參照文獻［13］進行。取無菌96 孔細胞培養板，每孔加入上述培養的細胞50 μl，調零孔不加細胞，每個樣品做3 個重復孔。每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)，繼續培養4 h，吸棄上清，每孔加100 μl 二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，測定OD570 nm 值。所得數據計算平均值，使用生物統計學中的方差分析法，進行差異顯著性檢驗。

1.8 淋巴細胞總蛋白和核蛋白提取 取上述培養的淋巴細胞，用PBS (pH7.2)稀釋至5.0 × 106ml-1。取200 μl 于離心管，液氮反復凍融和超聲波處理3 次，破壞細胞并使細胞內成份釋放，4℃，3 000 r/min 離心20 min。收集上清作為細胞總蛋白。

核蛋白提取按照試劑盒說明書要求操作，取上述培養的稀釋至5.0 ×106ml-1的淋巴細胞200 μl，4℃，1 000 r/min 離心10 min 收集細胞，加入200 μl預冷的提取液A，吹打混勻，置冰上15 min，每隔5 min 吹打混勻一次，均勻后于4℃，15 000 r/min 離心5 min 棄上清，沉淀用PBS 洗滌一次，于4℃，15 000 r/min 離心5 min，沉淀中加入200 μl 預冷的提取液B，吹打混勻，置冰上40 min，每隔10 min 渦旋振蕩一次，最后4℃，15 000 r/min 離心10 min，快速收集上清作為細胞核蛋白。

1.9 雞淋巴細胞總NF-κB 和核NF-κB 檢測 根據雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒說明書，對標準品按照900、600、300、150、75 ng/L 這5 個稀釋梯度進行稀釋。加樣時設空白孔、標準品孔、總NF-κB 和核NFκB 樣品孔，每孔加樣50 μl。37℃溫育30 min，洗板5 次，每孔加酶標試劑50 μl，37℃溫育30 min，洗板5 次，每孔加顯色液A、B 各50 μl，37℃顯色10 min，每孔加50 μl 終止液終止。以空白孔調零，450 nm波長依次檢測標準品及各組OD 值。根據所測五種濃度標準品的OD 值，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算雞淋巴細胞總NF-κB 和核NF-κB 含量。

2 結果

2.1 重組質粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IFN-α-IL-18 的鑒定 重組質粒pPICZ-IFN-α 以EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切，可切出3.6 kb 載體片段和0.5 kb 目的基因(圖1)。對重組質粒pPICZ-IFN-α-IL18 進行KpnⅠ/NotⅠ雙酶切，可切出3.6 kb 載體片段和1.0 kb融合基因(圖2)。

2.2 重組菌X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 和X-33/pPICZ-αA-IFN-α 的鑒定 對X-33/pPICZ-αA-IFNα-IL-18 和X-33/pPICZ-αA-IFN-α 單個菌落培養物基因組進行PCR 鑒定，均擴增出0.5 kb 的IFN-α 基因片段(圖3)。

2.3 表達產物的SDS-PAGE 及Western blot 分析 取誘導后96 h 重組菌X-33/pPICZ-IFN-α、X-33/pPICZ-IL-18 和X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18 上清液進行SDS-PAGE 電泳，與空載體對照菌比較，在分子量約為22、23 及43 kD 處有明顯的條帶(圖4A)。經Western blot 分析，確證為重組蛋白(圖4B)。

圖1 pPICZ-IFN-α 酶切鑒定Fig.1 Identification of pPICZ-IFN-α by digestion

圖2 pPICZ-IFN-α-IL-18 酶切鑒定Fig.2 Identification of pPICZ-IFN-α-IL-18 by digestion

圖3 重 組 菌 X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 和 X-33/pPICZ-αA-IFN-α 的PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 and X-33/pPICZ-αA-IFN-α

圖4 重組酵母發酵液上清中表達產物IFN-α、IL-18 以及IFN-α-IL-18 的SDS-PAGE 和Western blot 分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant IFN-α，IL-18 and IFN-α-IL-18 expression after retransformation

圖5 重組雞IFN-α-IL-18 對雞淋巴細胞生物學活性檢測結果Fig.5 Activation of chicken IFN-α-IL-18 to stimulated lymphocyte

2.4 雞淋巴細胞轉化試驗結果 用MTT 法測定酵母培養液對體外培養的淋巴細胞轉化和增殖活性，結果見圖5。

經統計學分析，誘導前，各組與空白對照組差別不大。培養24、48、72 h 后，IL-18 組和IFN-α-IL-18組均與空白對照組存在顯著差異(P＜0.05)，IFN-α組OD 值高于對照組，在作用48、72 h 時有顯著差異(P＜0.05，圖5)。表明含IL-18、IFN-α-IL-18 的重組質粒表達產物可以促進淋巴細胞增殖。IFN-α 對促進淋巴細胞增殖也有一定的作用。

2.5 雞淋巴細胞NF-κB 檢測分析 用雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒檢測各組淋巴細胞上清液的OD值，并根據標準品的濃度與OD 值，做出標準曲線的直線回歸方程式:y=0.001 4x +0.019 9(y:OD450nm;x:NF-κB 濃度)，計算各組淋巴細胞中總NF-κB濃度及核NF-κB 濃度。對所得數據進行方差分析，結果見圖6、圖7。

圖6 雞淋巴細胞總NF-κB 的檢測結果Fig.6 NF-κB concentration of chicken stimulated lymphocyte

圖7 雞淋巴細胞核NF-κB 的檢測結果Fig.7 NF-κB concentration of chicken stimulated lymphocyte nucleus

經統計學分析，誘導前，各組與對照組的總NFκB 濃度及核NF-κB 濃度皆差別不大。培養24、48、72 h 時，IL-18 和IFN-α-IL-18 組淋巴細胞總NF-κB濃度均與對照組存在顯著差異(P＜0.05)，IFN-α組總NF-κB 濃度高于空白對照組，僅72 h 后差異顯著(P＜0.05，圖6)。培養24、48、72 h 時，IL-18、IFN-α-IL-18 組的淋巴細胞核NF-κB 濃度均與對照組間存在極顯著差異(P＜0.01)，IFN-α 組48 h、72 h 時差異顯著(P＜0.05，圖7)。

3 討論

畢赤酵母表達系統對表達蛋白具有翻譯后的加工、修飾功能，其糖基化修飾程度與哺乳動物細胞相似，且表達量高，成本較昆蟲和哺乳動物細胞表達系統低，表達產物較易于純化［14］。利用基因重組技術將不同蛋白的基因融合，通過酵母表達系統可表達出兼具各自功能的蛋白［15，16］。本研究將雞IFN-α-IL-18 融合基因進行酵母表達，表達的IFN-α-IL-18融合蛋白具有促進淋巴細胞轉化活性，活化的淋巴細胞中總NF-κB 和核NF-κB 含量均顯著增加。表明IFN-α-IL-18 促淋轉活性與NF-κB 表達、活化及其核質轉運有關。

IL-18 具有誘生IFN-γ、促進T 細胞增殖分化、增強GM-CSF 的產生及NK 細胞和CTL 細胞活性的功能［17］。NF-κB 廣泛存在于各種細胞，參與免疫反應、炎性反應等多種反應物質基因的表達調控，在細胞增殖和凋亡中也發揮著重要的調控作用。NF-κB處于活化與失活的動態變化中。細胞在靜息狀態時，NF-κB 與IκB 偶聯形成無活性的三聚體存在于胞質中;當細胞受到細胞因子、病毒等因素刺激下，IκB 發生磷酸化、泛素化降解，NF-κB 核定位信號序列暴露，轉入核內與特定基因啟動子結合，調節相關基因表達［18，19］。活化后的NF-κB 與細胞增殖及凋亡有密切關系［20，21］。

實驗中發現，IFN-α-IL-18 融合蛋白和IL-18 的促淋巴細胞成熟作用比較明顯(P＜0.05)，淋巴細胞中總NF-κB(P＜0.05)和核NF-κB(P＜0.01)含量均顯著增加;IFN-α 促淋轉活性相對較弱，在后期對淋巴細胞成熟轉化表現出促進作用，細胞中總NF-κB 含量增加不明顯，但核中NF-κB 較非刺激的淋巴細胞中含量高(P＜0.05)，表明IL-18 及其融合蛋白IFN-α-IL-18 不但能夠誘導NF-κB 的表達，也能使NF-κB 活化進入細胞核。IFN-α 則主要通過激活NF-κB 活化進入細胞核調控淋巴細胞轉化成熟，盡管激活途徑尚需進一步研究，但也佐證了活化的NF-κB 具有促進細胞增殖的調控作用［22］。IFN-α-IL-18 融合蛋白與IL-18 和IFN-α 單體相比，在促淋巴細胞成熟和NF-κB 的表達、激活和轉運方面沒有明顯的變化，但說明融合后的生物學活性沒有改變，對于其是否兼具免疫增強和抗病毒兩方面的作用研究仍在進行之中。

本研究構建的重組IFN-α-IL-18 融合蛋白具有促進淋巴細胞轉化活性，其作用機制與NF-κB 表達及激活NF-κB 相關信號轉導途徑有關，這對進一步進行IFN-α-IL-18 融合蛋白免疫增強和抗病毒作用的研究具有積極意義。

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