重組BCG 的抑瘤活性及免疫學機制研究①

薛慶節 李秀真 李運清 楊媛媛 胡文潔 章洪華 呂厚東 李士根

(濟寧醫學院病原生物學教研室，醫學免疫學省級重點學科，濟寧 272067)

EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為1964 年Epstein 和Barr 等用改良組織培養技術自非洲兒童惡性淋巴瘤細胞培養物中發現的一種新型病毒，屬于雙鏈DNA 病毒，為人類皰疹病毒4 型。其具有嗜淋巴細胞的特性，在世界各地都有分布。在EBV 原發感染中，約半數患者出現傳染性單核細胞增多癥。非洲兒童惡性淋巴瘤及鼻咽癌易發于感染過EB 病毒的患者，故現在普遍認為EB 病毒是人類重要的腫瘤相關病毒［1］。本研究擬將文獻［2］構建成功的包含GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)基因與EB 病毒表面蛋白基因LMP2A 的重組BCG(rBCG)進行免疫學及抑瘤活性研究，進一步評價rBCG 的作用和效果。

1 材料與方法

1.1 材料 GT39(EB 病毒陽性胃癌細胞)為青島大學羅兵教授饋贈、FIFC 標記的兔抗鼠CD4、PE 標記的兔抗鼠CD8a 購自BD PharmingenTM公司;CTL殺傷活性檢測試劑盒為Promega 公司產品;小鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司;中性蛋白酶DISPASE 購自Roche 公司;6 周齡的C57BL/6 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司;鼠IFN-ELISPOT 預包被試劑盒購自北京曠博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒陽性腫瘤預防模型的建立及免疫策略 雌性6 周齡的C57BL/6 小鼠隨機分4 組，每組中有18 只小鼠，用6 只進行腫瘤細胞的形態學實驗、6 只需進行免疫機制分析、最后6 只需進行生存觀測。第一組注射PBS 作為對照;第二組注射BCG作為對照;第三組注射含空載體pMV261 的BCG 作對照;第四組注射含目的基因的重組BCG。

培養GT39 細胞，收集指數生長期細胞，用PBS調整細胞濃度，倒置顯微鏡計數，使濃度為1 ×107個/ml。無菌操作在2 只C57BL/6 雌性小鼠右肋腹側皮下，分別一次性接種250 μl/鼠。1 個月后處死荷瘤小鼠，無菌操作剝下瘤體。碾碎瘤體并勻漿，加4℃冰冷后的PBS 混合，200 目濾網過濾腫瘤細胞，用PBS 調細胞濃度為2 ×105個/ml，最后一次免疫后10 d 將培養好的腫瘤細胞無菌操作250 μl/鼠接種于C57BL/6 雌性小鼠右肋腹側皮下，9 d 后隨機分組。

對實驗小鼠C57BL/6 在進行腫瘤接種前30 d，連續3 次進行疫苗接種，中間間隔10 d，免疫時采用右肋腹側皮下注射的方式進行，第一組于右肋腹側皮下注射250 μl PBS/(次·只)作對照;第二組皮下注射250 μl BCG(5 ×108個細菌溶于250 μl PBS中)/次/只;第三組注射含空載體pMV261 的BCG(5 ×108個細菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只);第四組注射含目的基因的重組BCG(5 ×108個細菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只)。在最后一次免疫后10 d 接種腫瘤細胞。在接種腫瘤細胞后40 d 斷頸處死小鼠，手術剝離腫瘤并測定各種數據。

1.2.2 疫苗抑瘤活性測量與分析 觀察小鼠皮下腫瘤的生長情況，當可觸及腫瘤結節時，記錄其成瘤時間;然后每間隔2 d 用游標卡尺測量腫瘤垂直長徑(X)及短徑(Y)，計算其體積，公式為:腫瘤體積V=X×Y2/2，第40 天(從接種腫瘤細胞起)處死小鼠，手術剝離腫瘤，稱取瘤重，進行分析。統計各組瘤體積并計算抑瘤率，腫瘤生長抑制率的計算公式:抑制率(%)=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.3 ELISA 法檢測血清中特異性抗體 最后一次免疫后第10、20 天，取各實驗組小鼠眼眶靜脈血，室溫下4 h，然后離心(4 000 r/min，離心半徑10 cm)10 min，取血清，-20℃保存。用表達純化的GM-CSF、LMP2A 包被ELISA 板，檢測血清中有無特異性抗體及其滴度。

具體步驟如下:(1)用包被液稀釋純化的蛋白質GM-CSF、LMP2A 至濃度為3 μg/ml，100 μl/孔包被平板，冰箱內4℃過夜;(2)24 h 后，將包被液棄去，用ddH2O 洗板2 次并在吸水紙上扣干;(3)2%酪蛋白溶液封閉4 h，然后吸去封閉液，于吸水紙上扣干;(4)將100 μl/孔用PBS 倍比稀釋后的小鼠血清加入酶標板，37℃孵育1 h;(5)用PBST 洗板，共5次，然后加入羊抗鼠IgG(HRP 標記)抗體0.1 μg/ml，37℃孵育0.5 h;(6)PBST 洗5 次后，用A、B 液(H2O2+TMB)顯色，時間為15 min，最后用100 μl/孔硫酸(1 mol/L)終止反應，酶標儀檢測450 nm 的OD 值。

1.2.4 ELISPOT 法檢測脾臟細胞特異性細胞因子 單細胞懸液的制備:(1)在末次免疫后第10 天，處死小鼠，將其浸入75%酒精中5 min 后放入已滅菌的超凈臺內;(2)無菌操作取其脾臟，盡量去除脂肪、結締組織等，剪碎后置于200 目細胞篩中，將細胞篩放在含3%血清的PBS 的小燒杯中，用研磨杵擠壓出脾細胞;(3)用含2%血清的PBS 沖洗研磨出的脾細胞;(4)將淋巴細胞分離液5 加入到15 ml 離心管，將脾細胞懸液緩慢加入到分離液上方，2 500 r/min(離心半徑8 cm)冷凍離心機離心0.5 h;(5)取上層白膜，然后加10 ml 含血清PBS 洗2 次(1 200 r/min，5 min，離心半徑8 cm);在10 ml 無血清PBS 中重新懸浮并計算細胞的數量。

ELISPOT 法檢測脾細胞IFN-γ 分泌:實驗設陽性對照1 組(加PMA 刺激)，每個細胞樣品(來自同一小鼠)設1 組陰性對照(不加PMA)，另外設一組無細胞，只加檢測試劑、培養基的背景陰性對照。操作步驟如下:取出預包被的板，無血清培養基Lympho-SpotTM200 μl，靜止10 min，然后棄去;接種稀釋成的不同濃度細胞，細胞分布要均勻，100 μl/孔;陽性對照:濃度細胞2.5 ×105個/孔;細胞樣品:5 ×105個/孔;背景陰性對照:加無血清培養基礎100 μl陽性對照加10 μl 的PMA +離子霉素，使其終濃度為1 μg/ml，以刺激IFN 分泌;加刺激物GM-CSF、LMP2A 蛋白20 μg/孔;樣品加完后，放37℃CO2培養箱36 h。在CO2培養箱36 h 后，進行如下操作:(1)傾倒孔內的培養基，每孔加250 μl 冰冷去ddH2O，置于冰箱4℃下10 min，低滲裂解細胞;(2)棄去孔內液體，用緩沖液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水紙上扣干;(3)加入酶標親和素100 μl/孔，37℃下1 h，然后棄去孔內液體，用緩沖液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水紙上扣干;(4)將100 μl/孔AEC 顯色液加入，避光30 min，每5 min 檢查1 次;(5)當斑點生長到合適大小后，以ddH2O 洗2 遍，終止顯色。在吸水紙上倒扣反應板，當小水珠干后，取下保護層，置于室溫下，讓膜晾干;(6)在讀板機上將ELISPOT 反應板放好，調節好參數，測定斑點數據。

1.2.5 CTL 殺傷活性檢測 (1)制備效應細胞:無菌操作獲得rBCG 免疫后的小鼠脾細胞懸液，以15 U/ml 的IL-2 和2.5 μg/ml PHA-P 刺激淋巴細胞生長，另外，我們還加入表達純化的GM-CSF 蛋白質作刺激物，其濃度為30 μg/ml，CO2培養箱培養過夜后，加終濃度為25 U/ml 的IL-2。再次培養過夜后，每孔吸去0.5 ml 液體，補加含終濃度為25 U/ml 的IL-2 培養液，再培養2 d，把收獲的細胞作效應細胞。(2)制備靶細胞:EB 病毒陽性腫瘤細胞置于CO2培養箱中培養備用。(3)檢測CTL 活性的檢測(乳酸脫氫酶釋放法):按照試劑盒Non-Radioactive Cytotxixity Assay(Promega 公司)說明書操作規程進行:自然釋放組(效應細胞):收集并調整其細胞濃度，每孔加50 μl，最后補足至100 μl(用無血清培養基);自然釋放組(靶細胞):收集并調整其細胞濃度，每孔加1 ×105個/50 μl，最后補足至100 μl(用無血清培養基);最大釋放組(靶細胞):收集并調整其細胞濃度，每孔加1 ×105個/50 μl，最后補足至100 μl(用無血清培養基);背景釋放組:加100 μl 無血清培養基;實驗組:每孔加稀釋的效應細胞濃度分別是1 ×106個/50 μl、2 ×106個/50 μl、4 ×106個/50 μl，靶細胞1 ×105個/50 μl;1 200 r/min 離心5 min(離心半徑8 cm)，使其充分接觸，然后在37℃下CO2培養箱中培養5 h。在細胞孵育結束前40 min，將20 μl 5 ×裂解液加入到靶細胞最大釋放孔，培養結束后，3 000 r/min 離心5 min。將離心后獲得的上清50 μl 移入新96 孔酶標板中，每孔加入50 μl 底物，避光30 min，然后加50 μl 終止液，完成后讀出490 nm 吸光值。CTL 殺傷率的計算:實驗組=實驗組平均-培養基背景平均;效應細胞自然釋放值=效應細胞組自然釋放平均-培養基背景平均;靶細胞自然釋放值=靶細胞組自然釋放平均-培養基背景平均;靶細胞最大釋放值=靶細胞組最大釋放平均-體積糾正值平均。殺傷率(%)=實驗組釋放-效應細胞自然釋放-靶細胞自然釋放/靶細胞最大釋放-靶細胞自然釋放×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測 用手術刀剝下免疫小鼠的腫瘤，稱約0.4 g，放入6 ml 濃度為0.15%預熱蛋白酶溶液(pH7.0)中，于水浴中37℃裂解，用移液器輕吹裂解的腫瘤細胞，在裂解下來的腫瘤細胞中加入相等體積的1640 培養基。然后，將蛋白酶溶液(pH7.0)再次加入未能裂解的組織中，重復上述過程3 次，將中性蛋白酶裂解的腫瘤細胞收集在一起。將4 次裂解得到的腫瘤組織細胞離心(1 000 r/min)，獲得的細胞沉淀用1 ml PBS 緩沖液重懸，得到的溶液用200 目濾網過濾，離心收集過濾得到的細胞，用PE 標記兔抗鼠CD8a 抗體、FITC 標記兔抗鼠CD4 抗體(終濃度為2 μg/ml)100 μl 于4℃孵育2 h，然后用10 ml 清洗細胞3 次，用6 μl PBS 重新懸浮細胞沉淀，用流式細胞儀檢測免疫小鼠腫瘤中的CD8+、CD4+T 淋巴細胞的數量，并進行分析。

1.2.7 免疫小鼠腫瘤組織形態學觀察 對rBCG免疫后小鼠的腫瘤組織石蠟切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察分析其組織形態學變化及免疫后腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細胞是否出現。具體步驟如下:(1)腫瘤的剝離與固定:從免疫小鼠體內剝離腫瘤，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以維持細胞的固有形態與結構;(2)組織的脫水與透明化處理:腫瘤經65%、75%、85%乙醇逐級脫水各2 h，再浸入95%、無水乙醇各2 次，每次1.5 h，逐步脫去腫瘤組織中的水份。將脫水后的組織塊浸入二甲苯中進行透明處理;(3)包埋:把已透明化處理的腫瘤組織放入溶化的蠟中，置于恒溫箱保溫。當組織中完全被石蠟浸入后包埋;先疊好幾個小紙盒，倒入溶化后的液體石蠟，然后將浸透蠟的組織置于其中，蠟冷卻凝固后腫瘤可在其中長期保存;(4)切片:將包埋后的腫瘤固定于切片機上進行切片，切成5 μm 的薄片，為防皺褶的出現，將切下的薄片放入42℃水中;(5)貼片與烤片:將切片在水中伸展之后，用預先涂有1∶1蛋白甘油液的載玻片從水中撈取薄片，將薄片置于中心，晾干后置于37℃干燥箱中烘干;(6)脫蠟:將切片放入二甲苯20 min 以溶去石蠟，然后將其放入另一二甲苯液體漂洗20 min，最后放入二甲苯、無水乙醇(1∶1)溶液中3 min;(7)復原:脫蠟完成后將其置于無水乙醇2 min，然后放入另一新的無水乙醇2 min 以除去二甲苯;然后放入90%、80%、70%、60%、50%的酒精中各浸泡2 min，最后放入蒸餾水中泡2 min;(8)初染:將在蒸餾水中放置后的切片取出浸入蘇木精染液10 min;然后水中泡洗2～3 min;細胞質脫色:用鹽酸酒精分化至切片呈磚紅色(約15～20 s)，然后用自來水沖洗;(9)藍化:用1%氨水處理1～2 min，然后水漂洗1～2 min;(10)脫水:將切片重新置于65%、75%、85%、95%乙醇逐級脫水，時間各2 min;(11)復染:將切片置于95%酒精伊紅混合液中染色5 min，然后用無水乙醇浸泡2 min，共2 次，以完成對組織細胞的脫水;(12)透明化處理:經二甲苯二次各8 min 浸泡，使切處透明化及除去組織中的乙醇;(13)封固:將切片從第二次浸泡的二甲苯中取出，即可滴上中性加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固，平放于干燥處，稍加重壓，待干燥后觀察。

1.8 統計學分析 對各組數據整理后采用SPSS11.5 軟件進行統計學分析，成瘤時間以及腫瘤的重量、體積的采用隨機單因素方差分析(ANOVA)統計處理。每兩者之間差異進行t 檢驗，以P ≤0.05 差異有統計學意義，P≤0.01 作為差異非常顯著性標準。

2 結果

2.1 小鼠成瘤時間 各組小鼠的成瘤時間如表1所示，第一組時間約為8 d，第二組、第三組成瘤時間與第一組相比無顯著性差異;第四組成瘤時間最晚，約為20 d 左右才可以觸摸至腫瘤結節。與各對照組相比，差異達顯著水平(P≤0.05)，見表1。

2.2 小鼠的存活情況 在皮下接種腫瘤細胞后的100 d 內，第三天觀察小鼠的存活情況，結果發現，第一、第二、第三三個對照組在接種45 d 內全都死亡，而第四組重組BCG 免疫后的小鼠在90 d 仍有1只存活，與其余各組相比，差異達顯著水平(P ≤0.05)。

2.3 重組BCG 對腫瘤的抑制作用 結果見表2，可以看出，第一、二、三組平均瘤重差異不顯著，與各對照組相比，第四組平均重量明顯降低，其對腫瘤的抑制率為82%，與對照組的差異達顯著水平(P ≤0.05)。

表1 各組免疫小鼠皮下接種腫瘤細胞的成瘤時間Tab.1 Time of tumors formation in each immunized group after inoculation

2.4 ELISA 法檢測血清中特異性抗體 對于GMCSF 蛋白的包板，在最后一次免疫后10 d，第四組的抗體滴度為1∶14 800，在最后一次免疫后30 d，第四組的抗體為1∶4600。對于LMP2A蛋白包被的平板，分別為1∶10 000 和1∶1 000，都達非常顯著水平(P≤0.01)，見表3、4。

表2 重組BCG 對腫瘤的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of recombinant BCG on tumor

表3 小鼠血清抗體ELISA 檢測結果(GM-CSF 蛋白包板)Tab.3 ELISA results of mice serum antibody detection(GM-CSF protein coated board)

表4 小鼠血清抗體ELISA 檢測結果(LMP2A 蛋白包板)Tab.4 ELISA results of mice serum antibody detection(LMP2A protein coated board)

表5 各免疫組小鼠ELISPOT 計數結果Tab.5 Count results in ELISPOT of immunization mice

表6 CTL 特異性殺傷活性(%)Tab.6 Specific killing activity of CTL (%)

圖1 rBCG 免疫小鼠腫瘤組織腫瘤組織浸潤淋巴細胞Fig.1 Infiltrating lymphocytes of tumor tissue of mice immunized with rBCG

2.5 ELISPOT 法檢測小鼠IFN-γ 分泌水平 用GM-CSF、LMP2A 融合蛋白(20 μg/孔)作為刺激物對各組免疫小鼠的淋巴細胞進行刺激，對特異性抗原肽有反應的T 淋巴細胞被激活，進而分泌IFN-γ，這些因子被包被的IFN-γ 抗體捕獲并通過顯色的方式變成斑點。而對GM-CSF、LMP2A 融合蛋白沒有反應的淋巴細胞不會產生細胞因子，我們對所形成的斑點進行了計數，結果如表5 顯示。

2.6 特異性CTL 檢測 按試劑盒操作方法，設定效靶比(E/T)分別為10∶1、20∶1、40∶1，測 定OD490nm 值，分析CTL 活性，隨效靶比逐步增加，重組目的蛋白免疫組殺傷能力增加，這說明產生了對腫瘤細胞的特異性殺傷能力，而其他各組變化不明顯，重組BCG 組與對照組相比差異顯著(P ≤0.05)，結果如表6 所示。

2.7 形態學觀察腫瘤浸潤淋巴細胞 通過對免疫小鼠腫瘤組織的切片觀察，發現在經過重組BCG 免疫的腫瘤組織局部有淋巴細胞浸潤現象，如圖1 箭頭所示。

3 討論

癌癥是當今世界所面臨的最嚴重的疾病之一。傳統方法的治療是用手術切除腫瘤，然后進行化療和放療，以防止殘留的腫瘤細胞重新大量繁殖。但是，放療和化療有非常大的負作用，其在清除腫瘤細胞的同時，對人體正常的組織和細胞亦造成很大的傷害，且療效有限。

基因工程疫苗是使用DNA 重組技術，把天然的或人工合成的DNA 定向插入到哺乳動物細胞、真菌或細菌中，使之高效表達，經純化后而制備的疫苗。這種疫苗的構建通常使用高效表達質粒，將編碼特異性抗原的多肽或蛋白基因構建到這種質粒中，使其在哺乳動物細胞、真菌或細菌中表達，注射機體后，表達的抗原可激活免疫系統，進而誘導機體自身產生主動的、特異性的體液免疫和細胞免疫，從而達到預防和治療腫瘤的目的。

抗腫瘤基因工程疫苗是近年來發展起來的一種治療腫瘤的新方式，雖然出現的時間比較短，但其研究已獲得了很大的進展，其有效性已在實驗中得到驗證，部分疫苗已進入臨床試驗。

GM-CSF(Granulocyte/macrophase colony-stimulating factor，GM-CSF)全稱為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，由144aa 組成，它不但對樹突狀細胞具有調節作用，而且能促進其增殖與分化，維持細胞活力［3］。另外，該細胞因子還能對樹突狀細胞的分布和抗原提呈起重要調節作用。因此，被認為是抗腫瘤研究的重要細胞因子。研究表明，將其轉移至腫瘤細胞能極大增強腫瘤細胞的免疫原性，提高人體抗腫瘤反應［4-6］。LMP2A 為EB 病毒的潛伏膜蛋白基因，存在于被感染的B 淋巴細胞膜表面，具有阻止潛伏的EB 病毒再次被激活的作用，LMP2A 蛋白不但可刺激機體產生抗體，而且能引發機體CTL 反應［7-9］。Redchenko 等［10］用LMP2A 表位多肽負載DC，誘導出大量的特異性CTL。因此，EB 病毒表面膜蛋白基因LMP2A 可成為其相關腫瘤免疫治療的靶抗原。本研究設想將GM-CSF 與LMP2A 基因融合并轉入表達載體，讓其同時在細胞內表達，使機體產生針對EB 病毒陽性腫瘤細胞的體液免疫和細胞免疫，協同殺傷EBV 陽性腫瘤細胞。

卡介苗(BCG)是當今世界上應用的最廣泛的減毒活疫苗之一，其能形成胞內菌，既能刺激機體產生體液免疫，又能刺激機體產生細胞免疫。用作抗腫瘤研究的表達載體有其獨特的一面［11］。

從實驗中可以看出，重組BCG 可誘導C57BL/6小鼠產生較強抗腫瘤作用，對EB 病毒陽性腫瘤細胞具有明顯抑制作用。主要表現在腫瘤成瘤時間與其他對照相比明顯延遲，腫瘤生長明顯緩慢，小鼠生存期延長。這說明重組BCG 誘導機體產生了體液免疫和細胞免疫反應，對接種的腫瘤細胞產生了特異性殺傷。

ELISA 檢測結果表明，重組BCG 免疫后能產生針對GM-CSF 和LMP2A 的特異性IgG 抗體，用EB病毒陽性腫瘤細胞GT39 作為靶細胞，以經抗原肽刺激的免疫小鼠脾淋巴細胞作效應細胞，檢測特異性CTL。結果發現，在不同的效靶比設定值下，重組BCG 免疫組的小鼠都能檢測到特異性CTL 活性，統計分析結果表明，其已達顯著水平。

用ELISPOT 法檢測免疫小鼠淋巴細胞的IFN分泌情況，將無菌操作分離得到的重組BCG 免疫小鼠脾淋巴細胞用GM-CSF 蛋白質刺激后，加到預包被IFN-抗體的酶標板上，并通過對所形成的斑點計數，發現重組BCG 組檢測到的斑點數較多，而其余各對照組沒有檢測到IFN 的分泌，這說明重組BCG疫苗刺激機體后可誘導小鼠的細胞免疫反應。用流式細胞儀及形態學觀察的方法檢測腫瘤浸潤淋巴細胞，發現重組BCG 免疫的小鼠，其腫瘤組織中可檢測到有淋巴細胞的浸潤生長，這表明重組BCG 的免疫成功募集淋巴細胞到達腫瘤生長部位，出現浸潤現象。上述實驗為重組BCG 疫苗進一步的藥效學及藥理學研究奠定了基礎，為惡性腫瘤的預防提供了新思路和新方法。

［1］Chung GT，Lung RW，Hui AB，et al.Identification of a recurrent transforming UBR5-ZNF423 fusion gene in EBV-associated nasopharngeal carcinoma［J］.Pathol，2013，22(10):4240-4247.

［2］薛慶節，呂厚東，梁衛平，等.GM-SCF 與LMP2A 融合基因重組腺病毒載體的構建與鑒定［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20(5):1675-1680.

［3］Parviainen S，Ahonen M，Diaconu I，et al.GM-CSF-armed vaccinia virus induces an antitumor immune response［J］.Int J Cancer，2014，10(2):68-74.

［4］Heather SLJ，Tim DB，Margaret BJ，et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor treatment is associated with improved cognition in cancer patients［J］.Brain Disord Ther，2012，1(1):172-178.

［5］Furugaki K，Cui L，Kunisawa Y，et al..Intraperitoneal administration of a tumor-associated antigen SART3，CD40L and GM-CSF gene-loaded polyplex micelle elicits a vaccine effect in mouse tumor models［J］.PLOS One，2014，9(7):1854-1859.

［6］Van De Laar L，Coffer PJ，Woltman AM Regulation of dendritic cell development by GM-CSF:molecular control and implications for immune homeostasis and therapy ［J］.Blood，2012，119:3383-3393.

［7］Shaojun L，Qiaojuan G，Jin L，et al.The initial results of Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein-1 (LMP-1)for screening nasopharyngeal carcinoma (NPC)［J］.Chinese-German J Clin Oncol，2011，10(1):51-55.

［8］Portis T，Longneeker R.Epstein-Barr virus LMP2A interferes with g1obal transcription factor regulation when expressed during Blymphoeyte develoPment［J］.J Virol，2008，77:105-114.

［9］Ying X，Zhang R，Wang H，et al.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of LMP2A inhibits the growth of nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1 in vitro［J］.Gene，2014，524(1):77-82.

［10］Redchenko IV，Rickinson AB.Accessing Epstein-Barr virus specific T-cell memory with pep tide loaded dendritic cells［J］.J Virol，1999，73:3342-3421.

［11］Xue QJ，Dai J，Li XZ，et al.Construction of a recombinant-BCG containing the LMP2A and BZLF1 genes and its significance in the Epstein-Barr virus positive gastric carcinoma［J］.J Med Virol，2014，86(10):1780-1787.