膜突蛋白免疫大鼠制造肺動脈高壓模型的研究①

王 為 王 遷 李夢濤 曾小峰 (中國醫學科學院 北京協和醫院 風濕免疫科，北京 100005)

肺動脈高壓是結締組織病(Connective tissue disease，CTD)的嚴重并發癥，它與特發性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension，iPAH)同屬于肺高壓的第一類:動脈型肺動脈高壓。兩者具有相似的病理改變，即肺動脈平滑肌增生移行，新生內膜及叢樣病變形成［1］。目前針對CTD-PAH 的治療基本借鑒來自iPAH 的動物實驗及臨床研究結果，但現有觀點認為CTD-PAH 具有比iPAH 更為顯著的免疫損傷和炎癥反應，部分病人在接受激素和免疫抑制劑治療后肺動脈壓力有所降低，提示兩者在發病機制上仍存在不同［2］。因此，如能尋找到一種更接近CTD-PAH 發生發展機制的動物模型，無疑會對該疾病的診治提供巨大幫助。已有臨床研究證實抗膜突蛋白抗體與系統性硬化癥相關PAH 具有顯著相關性［3］。本實驗則將探尋膜突蛋白是否可使大鼠出現肺動脈高壓。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 成年雄性SD 大鼠35只，體重200～220 g，6 周齡，購自維通利華公司。動物飼養符合《北京市動物實驗管理條例》。隨機分組:陽性對照組(MCT 組)5 只，空白對照組5 只，佐劑對照組5 只，低劑量膜突蛋白免疫組(250 μg/次)10只，高劑量膜突蛋白免疫組(500 μg/次)10 只。

膜突蛋白原溶液及抗膜突蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒由上海富純中南生物技術有限公司提供。野百合堿(Monocrotaline，MCT)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 各實驗組的建立方案 (1)陽性對照組:將MCT 誘導肺動脈高壓動物模型作為本實驗的陽性對照，具體為:第0 天皮下注射MCT(60 mg/kg)。第0 天時通過內眥取血法留取血清，第21 天取大鼠進行肺動脈壓力測定，留取血清，處死后留取肺組織標本。(2)蛋白免疫組:用生理鹽水將膜突蛋白原溶液分別稀釋成為1、0.5 mg/ml，按照1∶1比例與弗氏完全佐劑混勻，獲得濃度分別為500、250 μg/ml的蛋白勻液，用于首次免疫;同樣的方法將蛋白液與弗氏不完全佐劑混合，所得蛋白勻液用于加強免疫。第0 天時按照相應劑量對大鼠進行首次免疫，第2周和第4 周加強免疫2 次。第0 天時通過內眥取血法留取血清。第6 周時取大鼠進行肺動脈壓力測定，留取血清，處死后留取肺組織標本。(3)空白對照組:不做任何處理，飼養條件同實驗動物。(4)佐劑對照組:將弗氏完全佐劑/不完全佐劑與生理鹽水1∶1等體積混勻，取1 ml 弗氏完全佐劑混懸液用于第0 天的首次免疫，取1 ml 弗氏不完全佐劑混懸液用于第2 周和第4 周的加強免疫。第0 天時通過內眥取血法留取血清，第6 周時取大鼠進行肺動脈壓力測定，留取血清，處死后留取肺組織標本。

1.2.2 血流動力學測定 大鼠麻醉后(25%烏拉坦1 250 mg/kg 腹腔注射)，利用BL-420E 生物機能實驗系統，通過右心導管測大鼠肺動脈壓;采集壓力波形后，行頸內動脈插管處放血處死大鼠，取大鼠肺臟病理。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學染色 大鼠組織經固定、包埋、切片、脫蠟和水化后行HE染色，×200 倍視野下對血管外徑100 μm 左右的小血管進行評價。應用抗平滑肌抗體對肺組織切片進行免疫組織化學染色，評估肺小動脈肌化的情況。

1.3 統計學處理 數據處理統計學軟件采用SPSS20.0，計量資料正態分布描述用±s 表示。用配對t 檢驗比較同大鼠免疫前后的血清抗膜突蛋白抗體OD 值。比較肺動脈壓力時采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 抗膜突蛋白抗體檢測 低劑量組大鼠免疫前血清抗體OD 值為0.132 ±0.049，實驗終點時血清抗體OD 值為1.903 ± 0.054，差異極顯著(P＜0.01)。高劑量組大鼠免疫前血清抗體OD值為0.125 ± 0.042，實 驗 終 點 時 為2.031 ±0.046，差異極顯著(P＜0.01)。高低劑量組抗體滴度之間無顯著差異(P ＞0.05)。佐劑對照組以及陽性對照組大鼠給藥前、后血清抗體OD值無顯著差異(P 均＞0.05)，證明這兩組大鼠體內無抗膜突蛋白抗體產生。

2.2 大鼠肺動脈壓力檢測及比較 低劑量組和高劑量組大鼠的平均肺動脈壓力分別為(20.6 ±2.9)mm-Hg 和(20.7±2.3)mmHg，空白對照組為(15.5 ±0.6)mmHg，蛋白免疫組的mPAP 均高于空白組，差異顯著(P=0.002，0.001)，但高、低劑量組之間無顯著差異(P=0.93)。佐劑對照組大鼠的mPAP 為(17.2±1.6)mmHg，與空白對照組間無顯著差異(P=0.065)。與佐劑對照組相比，蛋白免疫組的mPAP 均升高，差異顯著(P=0.03，0.013)。數據表明，經膜突蛋白免疫后，大鼠的平均肺動脈壓力明顯升高，用于免疫給藥的佐劑未對肺動脈壓力造成顯著影響。但蛋白免疫組的平均肺動脈壓力升高不及陽性對照組［(33.9±4.7)mmHg］顯著(P 均＜0.01)。

2.3 組織學比較 如圖1 所示，蛋白免疫組大鼠肺內出現散在的小血管(外徑100 μm左右)管壁增厚、管腔堵塞以及血管周圍灶性炎癥細胞浸潤等表現。但總體上看，實驗組大鼠病變血管的出現頻率較MCT 組小。200 倍鏡下隨機采集5 個視野，MCT 組的病變血管約10～15 支，而實驗組僅3～5支。免疫組化染色證實，平滑肌增生是造成血管管壁增厚和管腔堵塞的主要原因。

圖1 大鼠肺組織HE 染色及免疫組化染色Fig.1 Hematoxylin-eosin and immunochemistry staining of lung tissue

3 討論

膜突蛋白，又稱膜組織伸展棘突蛋白(membr ane-organizing extension spike protein，moesin)，于1988 年首次在牛的子宮平滑細胞中被發現，其理論相對分子質量為68 000，實際相對分子質量為78 000，由577 個氨基酸組成［4］。膜突蛋白通過介導細胞膜與肌動蛋白細胞骨架的連接，在細胞的生長、運動、遷移、有絲分裂以及信號轉導等方面發揮重要作用［5］。最初發現抗膜突蛋白抗體可能與CTD-PAH 具有相關性的研究來自于針對抗內皮細胞抗體(Anti-endothelial cell antibody，AECA)的研究［6，7］。AECA 實際上是一組識別血管內皮細胞表面多種抗原的抗體總稱，高度異質性限制了AECA的特異性。但有研究發現，AECA 識別的78 kD 抗原條帶對CTD-PAH 患者具有較高特異性，經分離純化鑒定，該抗原為膜突蛋白［8］。臨床研究發現抗膜突蛋白抗體與CTD 肺部損傷(PAH＆ILD)具有顯著相關性［3］。細胞水平研究結果則顯示，抗膜突蛋白抗體可能通過誘導肺微血管內皮細胞早期凋亡和改變細胞骨架結構而引起細胞損傷［9］。因此，無論是臨床層面還是基礎層面的研究，都提示抗膜突蛋白抗體可能與CTD-PAH 的發生具有相關性。因此，本實驗用膜突蛋白免疫大鼠，成功誘導大鼠產生抗膜突蛋白抗體，并證實這些大鼠的平均肺動脈壓力較空白對照和佐劑對照組顯著升高。病理組織研究發現該組大鼠出現肺小動脈管壁增厚、肌化，管腔堵塞以及血管壁周圍炎癥細胞浸潤等肺動脈高壓的典型病理改變，證明抗膜突蛋白抗體的確與肺動脈高壓存在相關性。這是目前國內外首個利用蛋白免疫的方法制造出肺動脈高壓動物模型的研究。

目前現有的肺高壓動物模型有MCT 大鼠PAH模型，慢性低氧誘導PH 模型，肺動脈結扎鼠類模型，基因敲除鼠類模型，以及IL-6、血管生成素或五羥色胺過表達模型等［10］。其中野百合堿誘導大鼠PAH 模型是目前最為常用且成熟的動脈型肺動脈高壓動物模型。在給大鼠注射MCT 1 周后，肺動脈內皮細胞即開始出現損傷、壞死和脫落。2、3 周后整個肺動脈血管發生纖維化、硬化，肺動脈血管管腔狹窄、血栓形成、堵塞，進而導致肺血管阻力增加、肺動脈壓力升高。與此同時，炎癥反應在MCT 誘發PAH 的過程中也扮演重要角色，病理學研究發現動物模型肺組織中有大量炎性細胞浸潤。因此，在所有現存PAH 動物模型中，MCT 被認為最為接近CTD-PAH 發病機制的動物模型。然而，化學損傷不能完全等同于免疫損傷，故MCT 不能完全模擬CTD-PAH 的發生發展，而本實驗的結果則顯示用膜突蛋白免疫大鼠有望提供一個最為接近CTD-PAH的動物模型。

但作為先驅研究，本實驗尚存不足。盡管設置了兩種濃度的蛋白用于免疫，實際上得到的抗體濃度以及肺動脈壓力卻無顯著差異。后續研究應增加濃度差，獲得不同的抗體滴度，以確定抗體滴度與肺動脈壓力之間是否存在相關性。此外，本實驗動物數量有限，限制了實驗結果的統計學效能，后續研究需增加實驗動物數量。另外需解釋的一點是，本實驗的蛋白免疫組和陽性對照組的實驗終點并不相同，這是基于免疫損傷不如藥物化學損傷迅速的考慮。蛋白免疫的過程本身就耗時4 周，產生抗體后造成免疫損傷可能需要的時間更久，而經典的MCT方法實驗終點最長21 d，大鼠可能不能存活到蛋白免疫組的實驗終點，因此只能設定不同的終點。本實驗選取6 周為實驗終點，盡管肺動脈壓力較空白對照已顯著升高，但距陽性對照還有較大差距，考慮可能與免疫損傷程度較輕、發展緩慢有關，后續實驗可延長實驗終點。

綜上所述，本實驗首次利用膜突蛋白免疫大鼠，成功地使大鼠出現肺動脈高壓，這是首個用免疫機制制造的肺動脈高壓模型，一方面證實抗膜突蛋白抗體與肺動脈高壓之間可能存在相關性，另一方面，也提供了一種最為接近CTD-PAH 發生機制的動物模型，為該疾病的診治提供極大幫助。

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