湖北漢族健康人群腫瘤轉移抑制基因Nm23 基因多態性的測定及分布①

楊春曉 劉亞妮 沈如飛 周嘉黎 羅小梅 張 玉 師少軍

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科，武漢 430022)

Nm23 最初于1988 年由Steeg 等［1］在小鼠黑色素瘤K-1735 細胞系中成功克隆分離出，位于染色體17q21.3，是首個被發現的腫瘤轉移抑制基因。目前人類基因組中已發現有10 個Nm23 家族成員，即Nm23-H1～-H7，Nm23-H8/TXNDC3，Nm23-H9/TXNDC6 及Nm23-H10/XRP2［2］。其蛋白質產物為核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinases，NDPK)。NDPK 廣泛存在于原核及真核生物界中，主要定位于細胞質、細胞核及核膜上，其首要的生物功能為催化5'-NDP 的γ-磷酸化作用，維持體內二磷酸核苷(NDP)與三磷酸核苷(NTP)代謝平衡。研究發現其還可作為蛋白激酶調節細胞生理功能、病理過程的諸多方面，如細胞分化、發育、增殖、凋亡，G蛋白信號轉導，微管聚合動力學，纖毛功能，DNA 突變、轉錄激活及腫瘤轉移等［3］。近年來對Nm23/NDPK 研究熱點主要集中在與惡性腫瘤的相關性上，大量研究證實Nm23 基因多態性與多種腫瘤的發生、發展及預后密切相關，包括消化道系統癌癥以及常見婦科腫瘤等［4］。其中多項研究表明，Nm23基因多態性是導致多種惡性腫瘤不良預后的重要因素［4］。對此，闡明易感基因，確立高危人群，重點篩查，及早治療是防止惡性腫瘤轉移，提高生存率的有效途徑。

目前研究還發現NDPK 可涉及多種藥物的體內代謝過程，包括嘌呤類藥物如硫唑嘌呤(AZA)、6-巰基嘌呤(6-MP)、6-硫鳥嘌呤［5，6］，細胞生長抑制劑如阿糖胞苷等［7］，抗代謝藥物如氟尿嘧啶［8］。上述藥物中，藥物反應個體差異明顯，不良反應發生率高。其中嘌呤類藥物不良反應發生率高達15%～28%，嚴重影響患者的生存質量。研究表明藥物代謝酶遺傳多態性是導致藥物反應個體、群體差異以及藥物不良反應的重要原因，因此，Nm23 基因多態性研究，對于改善、優化相關藥物治療，減少不良反應同樣具有重要臨床意義。本研究針對Nm23 基因啟動子及內含子區域rs16949649C/T、rs2302254C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs8075231C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C、rs2318785A/G 等10 個SNPs 位點建立了TaqMan-MGB 探針等位基因分型技術，并分析了200 例湖北武漢地區漢族健康人群上述位點基因型及等位基因的分布特點，補充了國內不同地區人群Nm23 基因多態性信息，并為進一步研究Nm23基因多態性與相關疾病或藥物不良反應關聯性及開展高危人群的防治提供試驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機抽取200 例于2012 年3 月至我院進行體檢的健康受試者，其中男性115 例，女性85 例。年齡19～59 歲，平均年齡34.18 歲，中位數年齡29 歲。所有研究對象均為湖北武漢地區漢族人群，相互間無血緣關系。男女性別間年齡比較無統計學差異。本次研究經華中科技大學醫學倫理委員會審核后進行，所有研究對象均自愿參加試驗并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 NANODROP1000 微量紫外分光光度計(Thermo)，ABI Prism?7900HT 型熒光定量PCR 儀，ABI--3130xl 測序儀，Veriti 梯度PCR 儀(Applied Biosystems AB)，瓊脂糖凝膠電泳系統(北京市六一儀器廠)，紫外核酸檢測儀(北京市六一儀器廠)，5804R 型高速冷凍離心機(Eppendorf)，XW-80A 型微型旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)，202-2AB 型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，HH-420 數顯恒溫水浴箱(金壇市大地自動化儀器廠)，10～1 000 μl 連續移液槍(Eppendorf)。

DP304 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒離心柱型(DP304-03，北京天根生化科技有限公司)。無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，TaqMan Genotyping Master Mix(Applied Biosystems AB)。TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems AB)，10 × PCR 緩沖液(TaKaRa)，dNTP混合液(TaKaRa)，熱啟動Taq DNA 聚合酶(Applied Biosystems AB)，瓊脂糖(BioWest)，Goldview 染料(上海賽百盛基因有限公司)，高度去離子甲酰胺(HiDi，Applied Biosystems AB)，BigDye V3.1(Applied Biosystems AB)、POP 7TM 測序膠(Applied Biosystems AB)。

1.3 TaqMan-MGB 探針和引物設計 引物和探針均由美國AB 公司設計及合成。每個SNP 位點所設計的兩條探針分別采用VIC 和FAM 進行熒光標記。各SNP 位點的兩條探針及正反引物混合之后貯液為40 倍濃縮液(40 ×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix)。

1.4 基因組DNA 提取 采集健康志愿者靜脈血2 ml，EDTA 抗凝，取200 μl 全血按DNA 提取試劑盒說明書抽提基因組DNA，TE 溶解，紫外分光光度儀測定DNA 濃度及純度(OD260 與OD280 比值)，其濃度均在1～20 ng，純度值均在1.6～2.0。測定后將所得DNA 于-80℃下保存。

1.5 SNP 位點選擇及基因分型 選擇Nm23 基因啟動子及內含子域rs16949649C/T、rs2302254C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs8075231C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C、rs2318785A/G 總計10 個SNP 位點。各位點詳細信息見表1。具體篩選條件為:①主要選擇位于啟動子區，編碼區錯義突變位點，內含子和外顯子交接處剪接區的SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/);② MAF-CHB ≥ 5% (http://www.hapmap.org);③SNP 功能預測(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm);④國內外已有報道與疾病相關的多態性位點［9-12］。

采用實時熒光TaqMan-MGB 探針等位基因分型技術對上述位點進行基因分型。PCR 反應體系為12.5 μl，內 含:TaqMan Universal PCR Master Mix 6.25 μl，40 × TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μl，基因組DNA(1～20 ng)1 μl，超純水4 μl。PCR 擴增反應條件為:95 ℃10 min 激活Ampli Taq酶;繼而92 ℃15 s 變性，60 ℃1 min 退火及延伸，共45 個循環。

1.6 TaqMan-MGB 分型結果的驗證 為驗證Taq-Man-MGB 基因分型結果的準確性，抽取30 例標本進行目的基因片段擴增后點選用6 個典型健康人基因組為模板(三種基因型中，每種基因型各2例)，引物設計采用Primer Premier 5 軟件完成，由武漢擎科生物科技有限公司合成和純化，異物序列見表2。PCR 反應體系為25 μl，內含:基因組DNA 1 μl，Ex-Taq DNA 聚合酶0.5 μl，正、反鏈引物各1 μl，10 ×Ex-Taq DNA 聚合酶緩沖液2.5 μl，4 ×dNTP Mixture 2 μl，滅菌去離子水17 μl。優化后的PCR反應條件為:95℃3 min 預變性，循環參數為95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，40 個循環后，72℃最終延伸7 min。取PCR 擴增產物2 μl，同3 μl 6 ×上樣緩沖液混合，于1% 瓊脂糖凝膠上電泳。取PCR 產物經乙醇/醋酸鈉法進行純化，純化步驟參照BigDye V3.1 操作手冊。純化后PCR 產物進行測序反應，反應體系10 μl，內含:DNA 純化物1 μl，BigDye 0.5 μl，正/反鏈引物0.5 μl，5 ×測序緩沖液1.875 μl，純化水7.125 μl。測序反應條件為:96℃1 min 預變性后進入循環，循環參數為96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，共30 個循環。測序產物采用乙醇/醋酸鈉法純化。于每份測序產物中加入10 μl HiDi，95℃變性5 min，迅速于冰上降溫5min。采用ABI--3130xl 測序儀測序。測序結果經ABI--3130xl Data Collection v 3.0 和Sequencing Analysis 5.3.1 軟件進行數據處理。

表1 SNP 位點特征Tab.1 Characteristics of 10 dbSNPs

1.7 統計學處理 應用SPSS17.0 統計軟件處理數據。等位基因及各基因型頻率采用直接計數法計算。Hardy-weinberg 平衡檢驗及等位基因、基因型頻率分布均采用χ2檢驗，以P＜0.05 表示有統計學差異，P＜0.01 為顯著性統計學差異。運用Helpoview 軟件進行連鎖不平衡分析，連鎖不平衡的程度用R2 表示。

表2 Nm23 基因上各多態性位點特異性核苷酸序列引物Tab.2 Primers for PCR of 10 SNPs in Nm23

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 為考察資料的可靠性，采用χ2檢驗將各SNPs 位點基因型分布進行Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗，結果表明各位點基因型的分布頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，說明選取的樣本具有代表性，可反映湖北武漢人群基因型分布特點。

2.2 SNP 位點多態性分布情況 所選Nm23 基因各SNP 位點在武漢地區漢族人群的基因型及等位基因分布頻率見表3。10 個SNP 位點在男性及女性群體中分布均無統計學差異。將測得武漢漢族人群Nm23 基因單核苷酸多態性與已有文獻及數據庫資料比較，試驗中所得到的武漢健康人群Nm23 基因各等位點等位基因頻率與相關文獻國內各區域研究結果及數據庫內北京漢族人群及日本人群結果基本接近，部分位點結果與非洲人群或歐洲人群中的研究結果差異較大，結果見表4。

2.3 連鎖不平衡 應用Heploview 軟件進行上述10 個SNP 位點兩兩配對連鎖不平衡分析，結果表明:rs16949649 與 rs7207370 (R2=0.915)、rs34214448(R2=0.873)，rs2159359 與rs2302254(R2=0.93)、rs8075231(R2=0.93)、rs2041296(R2=0.957)、rs8071647(R2=0.916)位點間高度連鎖不平衡，rs11868380、rs2318785 與其他位點之間相互獨立。見圖1。并最終篩選出4 個Tag SNPs:rs16949649、rs2159359、rs11868380、rs2318785。

表3 所選10 個SNP 在中國漢族人群中基因多態性分布頻率(n=200)Tab.3 Distribution frequency of 10 SNPs in Chinese Hans population(n=200)

表4 文獻或數據庫報道Nm23 基因單核苷酸多態性分布情況Tab.4 Reported distribution frequency of SNPs of Nm23 gene

表5 數據庫報道Nm23 基因單核苷酸多態性分布情況Tab.5 Reported distribution frequency of SNPs of Nm23 gene

圖1 10 個SNP 位點連鎖不平衡分析圖Fig.1 Linkage disequilibrium analysis for 10 SNPs in Nm23 gene

2.4 測序驗證 隨機抽取30 個樣本進行PCR 產物測序驗證，得典型DNA 測序圖，序列分析結果與TaqMan 檢測多態性位點基因型分型結果完全一致。表明TaqMan 探針法用于Nm23 基因SNP 分型結果準確可靠，證實了本研究的可靠性。圖2 為三種不同基因型樣本在位點rs2302254 的測序結果代表圖(檢測SNP 位點為箭頭標示處)。

圖2 Nm23 rs2302254 基因正向測序圖Fig.2 Sequence map of Nm23 gene

3 討論

Nm23/NDPK 廣泛分布于人體各組織中，其活性涉及細胞生理功能及病理過程的諸多方面，如調節細胞生長、分化、增殖、凋亡，介導G 蛋白信號轉導，調節RNA 轉錄等。近年來對其研究熱點主要集中在腫瘤轉移抑制活性上。臨床大量研究表明，Nm23/NDPK 表達水平與多種腫瘤的轉移潛能及臨床預后呈負相關，目前報道包括黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌［11］、膽囊癌［13］、唾液腺癌、喉癌、前列腺癌、上尿道癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等。

近年來，利用SNP 作為遺傳標記闡明基因多態性對機體因素、藥物效應尤其是不良反應的影響也迅速成為臨床醫學、藥物基因組學等領域的焦點。作為內源性代謝酶，NDPK 可涉及體內多種藥物的代謝，如前文所述嘌呤類藥物，阿糖胞苷及氟尿嘧啶等。Braunagel 等［7］報道指出Nm23/NDPK 基因多態性是引發阿糖胞苷不良反應的危險因素之一，rs2302254 TT 基因型患者使用阿糖胞苷時發生神經毒性危險性明顯增加。而Nm23/NDPK 基因多態性是否為引起嘌呤類藥物體內處置個體差異及不良反應的危險因素，目前尚無相關報道。

大量國內外研究表明，Nm23/NDPK 基因多態性，可導致其表達mRNA 及蛋白質水平的變化，從而影響惡性腫瘤的形成、轉移及預后等。如Yang等［13］報道指出，Nm23H1 基因D17S396 微衛星不穩定(MSI)及雜合度缺失(LOH)對消化道系統惡性腫瘤的發病機制、蛋白表達及腫瘤轉移過程中均存在一定相關性，其中D17S396 雜合度缺失(LOH)可降低Nm23 蛋白的表達，而D17S396 微衛星不穩定(MSI)現象則可促進Nm23 蛋白的表達。Hsieh等［14］證實了Nm23 基因EcoRⅠ位點突變純合子較野生純合子及雜合子肺癌發病風險更高。Feng等［4］研 究 表 明，啟 動 子 區 SNP rs16949649 和rs2302254 位點多態性可通過改變基因的轉錄活性而改變蛋白的表達水平，進而與宮頸癌的發病及預后密切相關，該研究同時發現rs34214448 TG、rs16949649 TC 可能為子宮頸癌變風險因素之一，而rs34214448 TT、rs16949649 CC 則為保護性因素。不同于Feng 等［4］的結論，Li 等［12］考察了302 例卵巢上皮癌患者Nm23/NDPK 基因多態性與卵巢上皮癌變易感性及臨床療效的關系，發現rs16949649 CC及rs2302254 TT 基因型攜帶者較其他基因型具有較短的無進展生存期(Progression-Free-Survival，PFS)及總生存期(Overall survival，OS)。相同趨勢也在Qu 等［15］，Li 等［16］研究中有過報道。

本試驗采用實時熒光TaqMan-MGB 探針等位基因分型技術對Nm23 基因啟動子及內含子區域rs16949649C/T、rs2302254C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs8075231C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C、rs2318785A/G 等10 個位點進行多態性檢測，并采用分片段擴增直接測序方法進行驗證，結果表明該方法特異、準確。試驗所得結果表明，上述10 個位點在湖北武漢地區人群中存在基因多態性，各位點基因型及等位基因分布無性別差異。比較國內相關研究及NCBI 數據發現，rs16949649、rs2302254 及rs34214448 在表4 中所列國內各區域研究結果均較接近，MAF 與數據庫內CHB、JPT 及表中其他人群結果基本接近。研究中所得rs11868380、rs8075231、rs2041296、rs2159359 等位點MAF 與JPT 及CEU 人群差異較小，但與Yoruba 人群分布差異較大。顯示出明顯的人種差異。提示我們:在進一步的研究中需注意不同人種、不同地區對基因多態性及相關藥物代謝酶的影響。此外，研究中發現，rs2318785 的MAF 與表5 中所列人群結果差異均較大，對其是否真代表為一種有異分布還需進一步大樣本的驗證。本研究還首次報道了rs7207370 及rs8071647 位點在湖北地區人群中MAF 信息，為湖北漢族人群Nm23 基因多態性提供了相關數據，之后本課題組將進行特定疾病人群中相關位點的多態性分析及基因多態性與蛋白活性相關性研究，進一步篩選有意義的功能位點，為考察Nm23/NDPK 基因多態性與相關疾病及藥物不良影響的相關性提供了研究基礎。

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