C3a、C5a 受體缺失減輕IgA 腎病腎損傷①

晏現麗 張 穎 鄭立運 任凌燕 周雅麗 權松霞 邢國蘭

(鄭州大學第一附屬醫院腎內科，鄭州 450052)

IgA 腎病為亞太地區最常見的原發性腎小球疾病［1］，對該病發病機制的探究雖歷經了近半個世紀，但目前發病機制仍不明確。既往研究多聚焦于IgA 分子的異常糖基化，然而IgA 分子的異常并非IgA 腎病唯一及主要發病機制［2］。有文獻報道補體可能是參與IgA 腎病發病的關鍵因素［3］。我課題組前期臨床研究中已發現C3a、C5a 在IgA 腎病病理損傷中發揮重要作用［4］，本研究旨在進一步探討C3a、C5a 在IgA 腎病發病中作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 6～8 周齡BALB/c 雌性小鼠28 只，SPF 級，體重18～23 g，7 只/組，其中野生型及陰性對照組購自鄭州大學動物實驗中心，C3a受體敲除組及C5a 受體敲除組小鼠通過南京大學南京生物醫藥研究院代購于美國Jackson 實驗室。仙臺病毒由中國科學院武漢病毒研究所惠贈，9 日齡SPF 級活雞胚購于北京梅里業維通實驗技術有限公司。

1.2 仙臺病毒的擴增及血凝價測定 0.2 ml 仙臺病毒濃縮液中加入1 ml 無菌生理鹽水稀釋后混勻，取0.15 ml 稀釋液接種于雞胚尿囊腔，接種后雞胚置于37℃恒溫箱中孵育，24 h 后觀察雞胚生長情況，活雞胚繼續孵育28 h 后取出置于4℃冰箱中過夜，次日吸取尿囊液3 000 r/min，4℃離心25 min，吸取上清。所獲病毒液參照以往方法［5］測定血凝價。

1.3 小鼠IgA 腎病模型建立 小鼠置于河南省醫藥科學研究院動物實驗室IVC 系統中適應性飼養3天，開始給予有活性病毒滴鼻，1 次/周，持續14 周(病毒量:第1、2 次2.5 ×104，第3 次2.5 ×105，第4次2.4 ×106，第5 至14 次均為1.92 ×108)，第6 及14 次同時給予含有6.25 ×108個病毒粒子混懸液尾靜脈注射;陰性對照組與實驗組同時間給予等量PBS 液;實驗期間所有小鼠自由采食、飲水。

1.4 生化指標測定 分別于實驗前及第15 周末于代謝籠中收集24 h 尿，采用CS400 自動生化儀檢測24 h 尿蛋白量。實驗前一天采用毛細管通過眼球后靜脈取血，0.2～0.3 ml/只;實驗結束后10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，摘取眼球取血，0.8～1.2 ml/只，所取血液于4℃冰箱靜置2 h，3 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，采用CS400 自動生化儀檢測血清尿素氮、肌酐值。

1.5 腎臟組織病理學檢查 10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，沿腹中線剖開腹腔，取出腎臟，剝離腎包膜，沿矢狀面剖開腎臟，再沿橫斷面切開腎臟，冰生理鹽水沖洗，取1/4 腎臟置于4%中性甲醛中固定，4℃過夜后石蠟包埋，制成3 μm 厚切片，經蘇木素-伊紅(HE)染色、過碘酸-希夫(PAS)染色、馬松三色(Masson)染色，光學顯微鏡觀察腎小球病理改變即免疫復合物沉積情況。取部分腎皮質包裹于濕生理鹽水紗布中，OCT 包埋后制成4 μm厚冰凍切片，室溫下涼片20 min，滴加異硫氰酸(FITC)標記的IgA 抗體(STAR137F AbD Serotec)及C3 抗體(sc-58926 Santa Cruz)，采用直接免疫熒光法檢測腎臟中IgA、C3 沉積情況。

1.6 腎組織中IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β mRNA 的實時熒光定量PCR 檢測 Trizol 法提取腎組織總RNA，測A(260nm)/A(280nm)值為1.8～2.0，凝膠電泳檢測所提取RNA 的完整性。按照反轉錄試劑盒(SK2425 上海生工)反轉錄為cDNA 后進行熒光定量PCR 反應。實時熒光定量PCR 引物見表1。反應體系20 μl:SybrGreen qPCR Maste Mix 10 μl，PCR 上、下游引物各1.0 μl，滅菌蒸餾水6.0 μl，cDNA 模板2.0 μl。反應條件:第1 階段，預變性95℃3 min;第2 階段，PCR 反應(95℃15 s，60℃40 s)40 個循環;第3 階段，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s;得到每個樣品的Ct 值。采用2-ΔCt計算目的基因相對表達量，采用GAPDH 作為內參基因。

1.7 統計學處理 采用SPSS17.0 進行統計分析，計量資料用±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 法，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

表1 實時熒光定量PCR 引物Tab.1 Primers of RT-qPCR

2 結果

2.1 一般情況 實驗過程中四組小鼠均無死亡，實驗組小鼠在第4 次給予病毒后出現活動減少，體重下降，部分小鼠喜蜷縮，毛發無光澤，實驗過程中所有小鼠無鼻腔膿性分泌物及肉眼血尿。

2.2 各組24 h 尿蛋白量及腎功能比較 建模后實驗組與陰性對照組比較尿蛋白量差異有統計學意義;C3a 受體敲除組、C5a 受體敲除組與野生型組比較尿蛋白量差異有統計學意義;四組之間血清肌酐及尿素氮及血清肌酐差異無統計學意義，見表2。

2.3 各組小鼠腎組織免疫熒光沉積強度 實驗組小鼠腎小球有較強IgA沿腎小球系膜區沉積，且野生型組熒光沉積強于其他兩組，陰性對照組則無IgA 沉積;C3 沉積情況同IgA，見圖1。

2.4 各組小鼠腎臟組織病理改變 實驗組小鼠腎組織均有不同程度的系膜細胞增生及系膜基質增多，部分伴有間質灶狀炎性細胞浸潤及小血管內皮細胞腫脹;系膜區可見嗜復紅蛋白沉積;且野生型組病理改變較C3a 受體敲除組及C5a 受體敲除組明顯;陰性對照組未見上述病理改變，見圖2 。

圖1 各組小鼠腎臟組織熒光沉積(×400)Fig.1 Deposition of IgA and C3 in glomerulus of four groups(×400)

圖2 各組小鼠腎臟組織病理改變(PAS 染色，×400)Fig.2 Renal pathology of four groups (PAS，×400)

表2 各組小鼠血清肌酐、尿素氮及24 h 尿蛋白量比較Tab.2 Serum blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)and 24 hours urine total protein(UTP)of different groups at weeks 0 and 14

圖3 各組小鼠腎臟組織炎癥因子及細胞因子mRNA 相對表達量Fig.3 Relative mRNA expression of inflammatory factors and cytokines in renal tissue

2.5 各組小鼠腎臟組織中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6、MCP-1mRNA 相對表達量比較 實驗組小鼠腎組織炎癥因子及細胞因子mRNA 相對表達量高于陰性對照組，同時野生型組高于C5a 受體敲除組及C3a 受體敲除組，另外IL-1β、IL-6、MCP-1 的mRNA相對表達量C5a 受體敲除組高于C3a 受體敲除組，差異具有統計學意義，見圖3。

3 討論

IgA 腎病1968 年由學者Berger 等提出，雖已歷經近半個世紀，但其發病機制仍不明確。本研究參照學者Emancipator 等［6，7］所采用方法建立小鼠IgA腎病模型，在此基礎上探究C3a、C5a 及其受體在IgA 腎病發病中的作用及其潛在機制。

有文獻證實補體旁路途徑及甘露糖結合凝集素途徑參與IgA 腎病發病，而C3a、C5a 是補體活化過程中所產生的主要致炎產物，有文獻報道［8-10］C3a、C5a 參與了缺血再灌注腎損傷、過敏性哮喘、糖尿病腎病等疾病發病，然而其在IgA 腎病中作用報道較少。余學清等［11］發現編碼補體調節因子H 因子及其受體的基因異常與IgA 腎病發病相關。我課題組［4］在前期的臨床回顧分析中也發現腎臟局部C3a、C5a 沉積強度及C3a 受體、C5a 受體表達強度與腎臟病理改變嚴重程度正相關。本研究中也發現C3a 受體敲除及C5a 受體敲除組小鼠在蛋白尿量、腎臟組織病理改變上均輕于野生型組。

C3a 受體及C5a 受體缺失主要通過阻止C3a 及C5a 與其結合減少炎癥因子及趨化因子分泌減輕腎臟損傷，其中C3a 受體缺失在減輕腎損傷方面發揮更強作用。Bao 等［12］發現C3a、C5a 在補體介導的腎小管腎間質損傷中發揮不同作用，C3a 受體缺失在減少腎小管間質中T 淋巴細胞及單核巨噬細胞浸潤的作用較C5a 受體缺失更顯著;Engelke 等［9］也發現C3a 受體缺失與C5a 受體缺失相比減少IL-1β 分泌的作用更強。我課題組［4］的前期研究中也發現腎臟局部C3a 受體表達陽性率與IgA 腎病24 h尿蛋白量及腎臟病理級別的相關性比C5aR 顯著。本研究中也發現C3a 受體缺失組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA 相對表達量低于C5a 受體缺失組，由于IL-1β、IL-6、MCP-1 主要由單核/巨噬細胞、T 淋巴細胞分泌［13］，既往研究又表明C3a 在趨化T 細胞及單核/巨噬細胞方面作用強于C5a，有意思的是本研究中并未發現C3a 受體敲除組與C5a受體敲除組小鼠在24 h 蛋白尿及腎臟病理改變上存在差異，這可能與本研究中所采用模型IgA 腎病病理改變本身較輕微，未見明顯腎小球硬化及腎小管間質病變等較重病理改變，再者，本研究所采用小鼠為C3a/C5a 受體單敲，敲除一種補體片段受體情況下不能完全排除另一種補體作用的干擾。

綜上所述，C3a、C5a 均參與IgA 腎病發病，C3a受體及C5a 受體缺失可減輕IgA 腎病腎損傷，同時C3a 在IgA 腎病發病中作用強于C5a。

［1］Woo KT，Chan CM，Chin YM，et al.The changing pattern of primary glomerulonephritis in Singapore and other countries over the past 3 decades［J］.Clin Nephrol，2010，74(5):372-383.

［2］Satake K，Shimizu Y，Sasaki Y，et al.Serum under-O-glycosylated IgA1 level is not correlated with glomerular IgA deposition based upon heterogeneity in the composition of immune complexes in IgA nephropathy［J］.BMC Nephrol，2014，Jun 13(15):89-102.

［3］Suzuki H，Kiryluk K，Novak J，et al.The pathophysiology of IgA nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22(10):1795-1803.

［4］段喜梅，張 穎，劉 璐，等.C3a、C5a 及其受體在IgA 腎病發病中的作用［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2013，48(3):313-319.

［5］索朗斯珠，吳慶俠.獸醫病毒學實驗技術［M］.北京:中國農業大學出版社，2013:40-44.

［6］Emancipator SN.Curr Protoc Immunol［M］.Wiley:New York，1999:1-18.

［7］Amore A，Coppo R，Nedrud JG，et al.The role of nasal tolerance in a model of IgA nephropathy induced in mice by Sendai virus［J］.Clin Immunol，2004，113(1):101-108.

［8］Peng Q，Li K，Smyth LA，et al.C3a and C5a promote renal ischemia-reperfusion injury［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23(9):1474-1485.

［9］Engelke C，Wiese AV，Schmudde，et al.Distinct roles of the anaphylatoxins C3a and C5a in dendritic cell-mediated allergic asthma［J］.J Immunol，2014，193(11):5387-5401.

［10］張朝甲，張 穎，劉 璐，等.補體C3a 及C5a 在糖尿病腎病發病中的作用［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2014，49(2):162-165.

［11］Yu XQ，Li M，Zhang H，et al.A genome-wide association study in Han Chinese idenfies multiple susceceptibility loci for IgA nephropathy［J］.Nat Genet，2011，44(2):178-182.

［12］Bao LH，Wang Y，Haas M，et al.Distinct roles for C3a and C5a in complement-induced tubulointerstitial injury［J］.Kidney Int，2011，80(5):524-534.

［13］龔非力.醫學免疫學［M］.第4 版.北京:科學出版社，2014:45-55.