參附注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠Nrf2 信號通路的影響①

江承平 吳碧華 王柏強 羅 飛 何效平 王曉明 劉黎明

(川北醫學院附屬醫院藥劑科，南充 637007)

隨著我國老齡化人口的加劇，缺血性腦血管病的發病率、致死率和致殘率呈現逐年增加的趨勢，給社會和家庭帶來沉重的經濟和精神負擔［1］。對于缺血性腦血管病的治療主要是在早期恢復缺血區的血流供應，然而再灌注后導致的腦損傷可以導致缺血所致的結構破壞和功能障礙進一步加重，因此，如何治療缺血再灌注導致的神經損害，是目前研究的難點和熱點。在以往研究中，本課題組及其他實驗室均發現參附注射液可以在腦缺血再灌注損傷模型中發揮顯著的神經保護作用［2，3］，然而對于其發揮神經保護作用的具體機制，目前尚未完全闡明。Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族中的一員，以往研究發現其在腦缺血再灌注損傷、腦外傷、蛛網膜下腔出血和脊髓損傷等中樞神經系統急性損傷中的病理過程中發揮重要作用［4］，本文通過探討參附注射液對Nrf2 信號通路的影響，以期進一步闡述參附注射液發揮腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 68 只健康雄性成年SD 大鼠，體重230～270 g，清潔級，由川北醫學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(川2008-18)，按隨機數字表法分為:假手術組，腦缺血再灌注組，參附注射液治療組;參附注射液購自雅安三九藥業有限公司生產，批號為: 991202;腦缺血再灌注模型的制作參照以往文獻［5］:使用水合氯醛(4 mg/kg)腹腔內注射將大鼠麻醉后，固定于手術臺上，常規剔除頸毛消毒，鋪無菌巾，將頸部皮膚切開后，暴露、分離出右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈和翼腭動脈，用絲線將頸總動脈近心端結扎，并用絲線在頸外動脈起始端結扎，采用微動脈夾將頸內動脈的遠端夾住，在頸總動脈的備用線近端距離頸外動脈分叉0.6 cm處，采用顯微剪刀剪開一小口，然后將先栓插進頸總動脈至微動脈夾處，使用備用線扎緊，松開動脈夾后，將線栓繼續插入到大腦中動脈起始部，以阻斷大腦中動脈的血流，當大鼠右側虹膜顏色開始變淺時，開始記錄缺血時間，同時逐層縫合切口出組織，于缺血后2 h 小心抽出栓線以實現缺血再灌注。術中嚴密監測大鼠的心率、血壓和體溫，使用電熱毯將大鼠體溫維持在生理范圍內。參附注射液在術后1 h 通過尾靜脈注射(8 mg/kg)，假手術組和模型組于術后1 h 給予尾靜脈注射生理鹽水處理(8 mg/kg)，所有實驗大鼠飼養于清潔環境，室溫20℃～24℃，避免強光及噪聲刺激，自由進食和飲水。

1.2 大鼠外傷后神經功能評分 大鼠缺血再灌注損傷后24 h 的神經功能評分采用Longa 法［6］:0 分未出現神經損傷癥狀，1 分不能完全伸展對側前爪;2 分:向對側轉圈;3 分:向對側傾倒;4 分:不能自發行走，意識喪失。

1.3 Western blot 法檢測 腦缺血再灌注24 h 后，使用水合氯醛將大鼠麻醉，經心尖灌注100 ml 的生理鹽水，取右側額頂葉腦皮質放入-80℃冰箱中保存待用。細胞核和細胞漿蛋白的提取參照試劑盒說明書進行，Bradford 法蛋白定量，按1∶4比例加入5×loading 沸水中煮10 min，變性，按每孔加入35 μg蛋白，電泳、轉膜后封閉1 h，加入Nrf2、cleavedcaspase-3、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)，醌氧化還原酶1［NAD(P)H，quinine oxidoreductase 1，NQO1］，β-actin，H3(1∶1 000，均購自美國cell signaling 公司)一抗稀釋液，4℃搖床過夜，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，洗膜，滴加ECL 發光液，曝光，Image J 軟件進行灰度分析。

1.4 尼氏染色結果分析 尼氏染色步驟參考以往文獻［7］。石蠟切片(4 μm)經 二甲苯中充分脫蠟后，將切片依次放入 無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min;然后放入尼氏染色液(碧云天)染色8 min，染色時溫度控制在37℃，蒸餾水洗滌2 次，95% 乙醇約5 s，可以用70%乙醇洗滌2 次后透明和封片，鏡下觀察并計數。

1.5 免疫組化染色步驟 將石蠟包埋的腦切片常規脫蠟和水化，PBS 充分沖洗后，蒸餾水浸泡后抗原修復，洗滌后滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育30 min。PBS 洗滌后滴加免疫血清封閉液(碧云天)，室溫孵育30 min 后滴加cleaved-caspase-3 稀釋液(1∶50)。PBS 沖洗后在37℃烘箱孵育1 h 后，PBS洗滌后滴加生物素標記的二抗(中山金橋，羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h。PBS 沖洗后滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min 后采用DAB顯色劑顯色。蒸餾水沖洗后，采用蘇木素復染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并計數。

1.6 統計學分析 采用SPSS15.0 軟件進行結果的處理，數據以±s 表示，神經功能評分采用Kruskal-Wallis 檢驗，其余多組間比較采用單因素方差分析進行。

2 結果

2.1 一般情況和神經功能評分 本研究共使用大鼠68 只，死亡8 只，假手術組大鼠未出現死亡，其中模型組死亡5 只，參附注射液治療組3 只，兩組死亡率無明顯差異，每組大鼠數量隨機補齊。假手術大鼠未出現神經功能評分缺損，與假手術組相比，腦缺血再灌注組大鼠的神經功能缺損評分顯著增加(4.05 ±0.19);參附注射液治療組的神經功能評分顯著降低(2.82 ±0.09)，兩組相比有顯著統計學差異(P＜0.05)。

圖1 各組中Nrf2 蛋白的表達量Fig.1 Expression of Nrf2 in each group

表1 各組中Nrf2、HO-1、NQO1 和cleaved-caspase-3 表達量及尼氏染色結果Tab.1 Analysis of Nrf2，HO-1，NQO1 and cleaved-caspase-3 expression and Nissl staining in each group

圖2 各組中HO-1，NQO1 和cleaved-caspase-3 的表達Fig.2 Expression of HO-1，NQO1 and cleaved-caspase-3 in each group

2.2 參附注射液對于Nrf2、HO-1 和NQO1 表達的影響 與假手術組相比(圖1，2;表1)，缺血再灌注組腦組織中Nrf2、HO-1 和NQO1 蛋白的表達明顯增加(P＜0.05);與缺血再灌注組大鼠相比，參附注射液治療可以進一步增加Nrf2，HO-1 和NQO1 蛋白的表達(圖1，2;表1，P＜0.05)。此外，參附注射液可以抑制腦缺血再灌注引起的cleaved-caspase-3 蛋白的表達(圖2;表1，P＜0.05)，這個結果在免疫組化染色中得到進一步的印證(圖3)。

2.3 尼氏染色結果 尼氏染色結果顯示，在假手術組中神經元大而圓，細胞形態完好;腦缺血再灌注組中，出現大量固縮的神經元，完整無損傷的神經元個數顯著減少(圖3，表1，P＜0.05);參附注射液治療組中，固縮神經元的數量明顯減少，完整神經元較腦缺血再灌注組顯著增加(圖3，P＜0.05)。

3 討論

在生理狀態下，Nrf2 主要與細胞質接頭蛋白Keap1 結合形成復合體存在于細胞漿中，當細胞受到親電試劑或者ROS 刺激時，Nrf2 發生磷酸化并與Keap1 蛋白發生解偶聯，脫離Keap1 蛋白束縛的蛋白質從胞漿中轉移到胞核內，與基因啟動子區域中的抗氧化反應元件序列結合，并啟動抗氧化酶、蛋白酶體和泛素酶的基因表達，顯著提高細胞的抗氧化應激能力。以往研究發現Nrf2 在腦缺血再灌注損傷模型中的表達量在2 h 增加至8 h 達到高峰［8］，給予Nrf2 的激活劑叔丁基對苯二酚可以顯著減少缺血再灌注導致的神經元凋亡和梗死面積，顯著改善神經功能評分［9］;而敲除Nrf2 基因的小鼠在腦缺血再灌注后其梗死面積明顯增加，神經功能缺損明顯加重;此外，研究還發現上調Nrf2 表達的藥物可以顯著減少神經元的損傷［10-12］，顯著改善神經功能的預后，提示上調Nrf2 信號通路的活性可以顯著改善腦缺血再灌注損傷的預后。

圖3 各組大鼠腦組織中cleaved-caspase-3 的免疫組化染色(上圖)和尼氏染色(下圖)結果Fig.3 Immunohistochemical analysis and Nissl staining of cleaved-caspase-3 in each group

本研究結果發現，參附注射液治療可以顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能評分，明顯減少受損神經元的個數，這與以往的研究具有一致性［13］，表明參附注射液具有良好的神經保護作用。進一步行機制研究發現，與假手術組相比，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Nrf2 蛋白的表達量在傷后24 h 顯著升高;此外，參附注射液可以進一步上調Nrf2 下游蛋白HO1 和NQO1 的表達量，這可能是其發揮抗氧化作用的機制。Cleaved-caspase-3 是凋亡的關鍵執行蛋白，以往大量研究表明cleavedcaspase-3 蛋白的表達量在腦缺血再灌注的腦組織中增加，從而導致神經元凋亡的發生，抑制cleavedcaspase-3 蛋白的表達量可以顯著減少腦缺血再灌注引起的神經元凋亡;在腦缺血再灌注模型中，Nrf2激活后可以顯著抑制cleaved-caspase-3 蛋白的表達，減少神經元的損害［14］;本研究結果表明參附注射液可以顯著抑制凋亡關鍵執行蛋白cleavedcaspase-3 的表達量，從而減少神經元的損傷程度，改善神經功能缺損評分。結合以往研究結果，提示參附注射液可能通過上調Nrf2 信號通路的活性在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用。綜上所述，參附注射液治療可以顯著上調腦缺血再灌注后Nrf2 蛋白的表達，并調節下游一系列產物的表達，這可能是參附注射液發揮神經保護作用的機制之一。

［1］劉 敏，方向華.腦卒中后殘疾的研究進展［J］.中華流行病學雜志，2013，34(11):1146-1150.

［2］江承平，劉 福，李 毅，等.腦缺血再灌注損傷模型大鼠參附注射液干預后熱休克蛋白70 的表達［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(41):7661-7664.

［3］江承平，劉 福，李 毅，等.參附注射液對腦缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB2 及6-keto-PGF1a 的影響及意義［J］.中國醫科大學學報，2012，41(2):124-127.

［4］Zhang M，An C，Gao Y，et al.Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection［J］.Prog Neurobiol，2013，100:30-47.

［5］Varshosaz J，Taymouri S，Pardakhty A，et al.Niosomes of ascorbic acid and alpha-tocopherol in the cerebral ischemia-reperfusion Model in male rats［J］.Biomed Res Int，2014，2014:816103.

［6］Yan C，Zhang J，Wang S，et al.Neuroprotective effects of rutaecarpine on cerebral ischemia reperfusion injury［J］.Neural Regen Res，2013，8(22):2030-2038.

［7］Zhuang Z，Zhou ML，You WC，et al.Hydrogen-rich saline alleviates early brain injury via reducing oxidative stress and brain edema following experimental subarachnoid hemorrhage in rabbits［J］.BMC Neurosci，2012，13:47.

［8］Tanaka N，Ikeda Y，Ohta Y，et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Brain Res，2011，1370:246-253.

［9］Kam KY，Yu SJ，Jeong N，et al.p-Hydroxybenzyl alcohol prevents brain injury and behavioral impairment by activating Nrf2，PDI，and neurotrophic factor genes in a rat model of brain ischemia［J］.Mol Cells，2011，31(3):209-215.

［10］Li M，Zhang X，Cui L，et al.The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2-related factor 2(nrf2)-mediated antioxidant response:role of nrf2 and hemeoxygenase-1 expression［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(5):595-601.

［11］Ding Y，Chen M，Wang M，et al.Neuroprotection by acetyl-11-keto-beta-Boswellic acid，in ischemic brain injury involves the Nrf2/HO-1 defense pathway［J］.Sci Rep，2014，4:7002.

［12］Ding Y，Chen M，Wang M，et al.Posttreatment with 11-Keto-beta-Boswellic acid ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury:Nrf2/HO-1 pathway as a potential mechanism［J］.Mol Neurobiol，2014，10.1007/s12035-014-8929-9.

［13］江承平，劉 福，李 毅，等.參附注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9 和TIMP-1 表達的影響［J］.中華神經醫學雜志，2012，11(1):20-23.

［14］Li M，Zhang X，Cui L，et al.The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2-related factor 2(nrf2)-mediated antioxidant response:role of nrf2 and hemeoxygenase-1 expression［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(5):595-601.