紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R 表達的影響

張新勝 程 航 徐曼曼 祝彼得 (河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007)

既往研究表明，紅景天的提取物對γ 射線輻射損傷或環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓抑制造血祖細胞有促進增殖的作用［1］。我們以往的研究也表明，一定劑量的紅景天苷能促進骨髓抑制貧血小鼠骨髓造血功能的恢復［2］。骨髓具有豐富的神經(jīng)支配，進入骨髓的神經(jīng)分支后分布于血管外膜、造血細胞之間以及骨髓竇等處，提示神經(jīng)終末釋放的物質可能參與造血微環(huán)境的形成［3］。骨髓中最富有代表性的終末之一是釋放SP 的神經(jīng)終末。SP 是一個哺乳類普遍存在的含11 個氨基酸的神經(jīng)肽，屬于結構上相關的速激肽(Tachykinins，TKs)家族，其廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)［3-5］。SP 不僅與心血管、神經(jīng)、呼吸和免疫系統(tǒng)的許多生理過程密切相關［5］，似乎還具有刺激造血的作用［6］。目前SP 及其受體NK-1R 是否參與紅景天苷促進骨髓造血功能恢復的過程尚不清楚。本研究采用骨髓抑制貧血小鼠模型，用免疫組織化學方法和RT-PCR 技術觀察了紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠骨髓細胞SP 及其受體NK-1R 表達的變化，探討SP 及其受體NK-1R 在促進骨髓造血恢復中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 紅景天苷(純度為95%)，成都明波生物技術有限公司提供;環(huán)磷酰胺為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品;60Coγ 源由四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所提供;SP 和NK-1R 多克隆抗體、免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒等均購自武漢博士德生物工程有限公司;RNAiso Reagent、RT-PCR Kit 購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 實驗動物 8～12 周齡BALB/c 健康雄性小鼠40 只，體質量18～22 g，四川大學華西實驗動物中心提供。

1.3 骨髓抑制貧血動物模型的制備 參照本實驗室常規(guī)方法造模［2］。具體方法是:小鼠經(jīng)2.0Gy60Co 照射后的第4 天開始每天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)40 mg/kg(于臨用前配制)、氯霉素50 mg/kg，連續(xù)給藥3 d 完成模型制備。

1.4 動物分組與給藥 將小鼠隨機分為對照組、模型組、紅景天苷低劑量、中劑量和高劑量組，每組8只。除對照組外，其他4 組均進行造模。小鼠造模完成的第2 天，紅景天苷低劑量、中劑量和高劑量組開始腹腔注射紅景天苷(無菌生理鹽水配制)，劑量分別為10、20 和40 mg/kg，每只小鼠每天腹腔注射0.2 ml。對照組和模型組每只小鼠每天腹腔注射0.2 ml 的生理鹽水。連續(xù)注射7 d。

1.5 外周血細胞計數(shù) 在末次給藥(或給生理鹽水)后24 h，經(jīng)小鼠眼眶后靜脈叢采血20 μl 稀釋后用HS-18 型全自動血細胞分析儀進行血常規(guī)檢測。

1.6 SP 及其受體NK-1R 表達檢測 采用免疫組織化學法。在末次給藥(或給生理鹽水)后24 h(造模后第8 天)分別取各組小鼠的股骨，4%的多聚甲醛固定，EDTA 脫鈣，常規(guī)制作石蠟切片。按SABC檢測試劑盒步驟分別檢測SP 及其受體NK-1R 的表達。PBS 替代一抗做陰性對照。

1.7 SP 及其受體NK-1R mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 技術。在末次給藥(或給生理鹽水)后24 h(造模后第8 天)分別取各組動物的股骨，用適量的IMDM 培養(yǎng)基分別沖出各組動物的骨髓，離心(1 000 r/min，5 min，4℃)后取骨髓細胞。按RNA提取試劑說明書提取骨髓細胞的總RNA。用紫外分光光度計測定樣品A260 及A280，根據(jù)A260 值將各個樣品總RNA 稀釋至相同濃度。各取2 μg 總RNA 按RT-PCR 試劑盒說明進行操作逆轉錄合成cDNA，等量取cDNA，用相對應的引物對SP 和NK-1R 的基因片段進行擴增。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列:SP:上游5'-GTTTCCACTCAACTGTTTGCAG-3'，下 游 5'-CTCTTTTGCCCATTAGTCCAAC-3'，擴增片段長度295 bp;NK-1R:上游5'-CCACAAGAGAATGAGGACAGTG-3'，下游5'-CATAGCCAATCACCAGCAGAG-3'，擴增片段長度467 bp;3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH):上游5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3'，下游5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，擴增片段長度289 bp。PCR 反應參數(shù):94℃，2 min;94℃變性，30 s;退火(上述3 個引物擴增時的退火溫度分別為55℃、55℃和54℃)30 s;72℃延伸，1 min，擴增35 循環(huán);72℃，10 min。取5 μl PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用GoldVeiw DNA 染料染色。

1.8 圖像分析方法 采集的SP 和NK-1R 免疫組織化學染色圖像，用Image-Pro Plus 分析軟件進行圖像分析，每張切片取5 個視野測定小鼠骨髓細胞SP和NK-1R 蛋白陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD 值)，取平均值代表SP 和NK-1R 蛋白表達強度。瓊脂糖電泳凝膠條帶經(jīng)BIO RAD Quantity one 4.4.0 圖像分析系統(tǒng)采集電泳圖像，并進行半定量分析，結果用各基因擴增條帶光密度值與內參照GAPDH 光密度值的比值表示。

2 結果

2.1 紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠外周血的影響 外周血檢測結果顯示(見表1)，與對照組相比，模型組WBC、RBC 和HB 均明顯降低。與模型組相比，低劑量、中劑量和高劑量紅景天苷組均能明顯升高外周血WBC 數(shù)，中劑量紅景天苷組均能明顯升高外周血PLT 數(shù)。各劑量紅景天苷組對外周血RBC 和HB 未見明顯的促進作用。

2.2 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R 表達的影響 免疫組織化學結果顯示，在對照組、模型組和各劑量紅景天苷組小鼠骨髓細胞中均檢測到SP和NK-1R 表達，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒。與對照組相比，模型組骨髓細胞中SP 表達明顯降低(P＜0.05)，而各劑量紅景天苷組骨髓細胞中SP 表達明顯增強(P＜0.05)。與模型組相比，各劑量紅景天苷組骨髓細胞中SP 表達明顯增強(P＜0.05)，而且表達強度隨用藥劑量的增加而增強(見圖1、2、表2)。在對照組和模型組中均有較微弱的NK-1R 表達，二者比較，無顯著性差異(P ＞0.05)。與對照組或模型組相比，各劑量紅景天苷組骨髓細胞中NK-1R 表達均明顯增強，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而且表達強度隨用藥劑量的增加而增強(見圖1、2、表2)。

表1 紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠外周血的影響(±s，n=8)Tab.1 Effect of salidroside on peripheral blood cells of bone marrow depressed anemia mice(±s，n=8)

表1 紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠外周血的影響(±s，n=8)Tab.1 Effect of salidroside on peripheral blood cells of bone marrow depressed anemia mice(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs low-dose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group.

圖1 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 表達的影響(SABC，×400)Fig.1 Effect of salidroside on SP expression of bone marrow cells(SABC，×400)

圖2 紅景天苷對小鼠骨髓細胞NK-1R 表達的影響(SABC，×400)Fig.2 Effect of salidroside on NK-1R expression of bone marrow cells(SABC，×400)

表2 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R 表達的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of salidroside on SP and NK-1R expression of bone marrow cells(±s，n=8)

表2 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R 表達的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of salidroside on SP and NK-1R expression of bone marrow cells(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs lowdose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group.

表3 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R mRNA 表達的影響(±s，n=8)Tab.3 Effects of salidroside on SP and NK-1R mRNA expression of bone marrow cells(±s，n=8)

表3 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 和NK-1R mRNA 表達的影響(±s，n=8)Tab.3 Effects of salidroside on SP and NK-1R mRNA expression of bone marrow cells(±s，n=8)

Note:1)P＜0.05 vs control group;2)P＜0.05 vs model group;3)P＜0.05 vs lowdose group;4)P＜0.05 vs middle-dose group;-.Not detected.

圖3 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP mRNA 表達的影響Fig.3 Effect of salidroside on SP mRNA expression of bone marrow cells

圖4 紅景天苷對小鼠骨髓細胞NK-1R mRNA 表達的影響Fig.4 Effect of salidroside on NK-1R mRNA expression of bone marrow cells

2.3 紅景天苷對小鼠骨髓細胞SP 及其受體NK-1R mRNA 表達的影響 RT-PCR 結果顯示，在對照組、模型組和各劑量紅景天苷組小鼠骨髓細胞中均檢測到SP mRNA 的表達(見圖3、表3)。與對照組相比，模型組和各劑量紅景天苷組骨髓細胞中SP mRNA 表達明顯增強(P＜0.05)。與模型組相比，各劑量紅景天苷組骨髓細胞中SP mRNA 表達明顯增強(P＜0.05)，而且表達強度隨用藥劑量的增加而增強。在對照組和模型組中均未檢測到NK-1R mRNA的表達，而在紅景天苷三個劑量組骨髓細胞中均檢測到NK-1R mRNA 的表達，三者兩兩比較，差異顯著，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而且mRNA 表達水平隨用藥劑量的增加而升高(見圖4、表3)。

3 討論

骨髓從結構上可以分為兩個密切相關的部分:造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)和造血微環(huán)境(Hematopoietic microenvironment，HM)。造血微環(huán)境是造血干細胞增殖、發(fā)育和分化的場所，造血微環(huán)境中的細胞應答不同的刺激可以引起一些可溶性因子如細胞因子、神經(jīng)肽、神經(jīng)營養(yǎng)因子等的產(chǎn)生，以支持造血［7，8］。造血調控的一個主要機制涉及到其與神經(jīng)系統(tǒng)之間的雙向通訊交流，神經(jīng)遞質可與細胞因子形成一個復雜的網(wǎng)絡來調控造血［9］。SP 是TKs 家族的主要成員，其作為神經(jīng)遞質、神經(jīng)調質或生長因子參與許多生理過程［10］。SP 在調節(jié)免疫應答方面的作用已被廣泛研究，但在造血方面的研究少有報道。Kang 等［9］的研究顯示，分布于骨髓中的SP 有2 種來源，一是來源于支配骨髓的神經(jīng)，二是來源于骨髓細胞。Rameshwar 等［4］的研究顯示，骨髓細胞既表達SP，也表達SP 受體NK-1R。SP 可通過與其優(yōu)先受體NK-1R 之間的相互作用來發(fā)揮其刺激造血的作用［6］。在體外的一些研究發(fā)現(xiàn)，SP 具有刺激紅系和粒系祖細胞增殖的作用，在缺乏外源性造血生長因子(Hematopoietic growth factors，HGFs)情況下，SP 單獨使用，能夠維持體外造血［6，11，12］。本研究中，我們用60Coγ 射線、環(huán)磷酰胺和氯霉素結合的方法處理小鼠制備骨髓抑制貧血小鼠模型，結果顯示造模后模型組小鼠外周血WBC、RBC 和HB 明顯降低，表明造模成功。本研究結果還顯示，一定劑量的紅景天苷對外周血WBC 和PLT的恢復有明顯的促進作用，進一步證實一定劑量的紅景天苷能促進骨髓抑制貧血小鼠骨髓造血功能的恢復［2］。在上述研究的基礎上，本研究又觀察了紅景天苷對骨髓抑制貧血小鼠骨髓細胞SP 及其受體NK-1R 表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，對照組、模型組和各劑量紅景天苷組小鼠骨髓細胞中均檢測到SP 和NK-1R 的表達，而且對照組中檢測到SP 和NK-1R表達的結果與Rameshwar 等［4］研究結果是一致的。造模后骨髓細胞中SP 表達明顯降低，NK-1R 的表達雖然有所降低，但無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。在各劑量紅景天苷組骨髓細胞中SP 和NK-1R 的表達均明顯增強，而且表達強度隨用藥劑量的增加而增強，表明紅景天苷可以促進SP 和NK-1R 在骨髓細胞中的表達，而且有劑量依賴性。另外，RT-PCR 結果顯示，在對照組、模型組和各劑量紅景天苷組小鼠骨髓細胞中均檢測到SP mRNA 的表達，這與上述免疫組化的結果相符。雖然有研究報道在未刺激的骨髓細胞中NK-1R 的表達低到檢測不到的水平［13］，我們用免疫組化法還是在對照組檢測到了較弱的NK-1R 的表達，但用RT-PCR 技術在我們目前使用的條件下未能檢測到NK-1R mRNA 的表達，這也說明未刺激的骨髓細胞中NK-1R 的表達水平確實非常低。另外有研究表明，NK-1R 具有組織特異性調節(jié)特性，它在神經(jīng)細胞呈現(xiàn)構成性表達，而在骨髓基質細胞可被誘導產(chǎn)生［9］。我們在造模組骨髓細胞中未檢測到NK-1R mRNA 的表達，但在各劑量紅景天苷組小鼠骨髓細胞中均檢測到NK-1R mRNA 的表達，而且表達強度也隨用藥劑量的增加而增強，這個結果不僅與上述免疫組化的結果相符，也進一步表明紅景天苷可誘導NK-1R mRNA 的表達。所以，無論是從蛋白質水平，還是從基因水平都反映出紅景天苷能明顯促進小鼠骨髓細胞中SP 及其受體NK-1R 的表達。該結果提示，紅景天苷促進骨髓造血功能的恢復可能與SP 和NK-1R 的表達增強密切相關。

既往的研究還提示，SP 通過與其特異性受體NK-1R 相結合來發(fā)揮其生物學效應，從而導致骨髓細胞產(chǎn)生了一些與造血有關的細胞因子，包括IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF 和干細胞因子(Stem cell factor，SCF)［14］。SP 誘導產(chǎn)生的這些細胞因子又能激活骨髓細胞，使其通過一種自分泌和/或旁分泌的機制產(chǎn)生其他一些具有刺激造血作用的細胞因子［4］。SP與細胞因子之間的相互誘導，就形成了一個調控造血的網(wǎng)絡，為造血干細胞的增殖、發(fā)育、分化和遷移營造了一個良好的環(huán)境。另外有研究顯示，SP 在體外刺激造血的作用部分可被抗IL-1、IL-3、IL-6 和GM-CSF 的抗體所減弱［8］。這似乎表明SP 調控造血的生理作用，至少部分是通過骨髓細胞和HGFs的釋放來起作用的。因此，本研究中，紅景天苷可能通過促進小鼠骨髓細胞中SP 及其受體NK-1R 的表達，進而通過SP 與NK-1R 的特異性結合，導致骨髓細胞釋放HGFs 來促進骨髓抑制貧血小鼠骨髓造血功能的恢復。

還有研究顯示，SP 作為一種抗凋亡因子既可以保護培養(yǎng)的腱細胞免受TNF-α 誘導的凋亡［15］，又可保護骨髓細胞免受骨髓低氧引起的損傷［16］。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過升高小鼠骨髓細胞Bcl-2 的表達、降低Bax 的表達來保護骨髓細胞免受放、化療引起的骨髓抑制性貧血小鼠骨髓細胞的凋亡［2］，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可促進小鼠骨髓細胞中SP 的表達，所以紅景天苷抗骨髓細胞凋亡的作用也可能有SP 的參與。

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