Gab2 過表達對人結直腸癌SW480 細胞株增殖和遷移的影響①

丁陳波 馮繼紅 楊麗文 李龍梅 李姍姍 陳 超 羅軍敏

(遵義醫學院免疫學教研室，貴州省免疫學研究生教育創新基地，遵義 563003)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率逐年增高，且死亡率在所有消化道腫瘤中增長最快。快的增長率和腫瘤細胞轉移是導致其生存率降低的兩大主要原因，抑制腫瘤生長及轉移，促進其凋亡可以達到降低死亡率的目的。支架蛋白Gab2(Grb2-associated binding protein 2)作為Gabs 家族蛋白(Grb2-associated binder family proteins)最主要成員之一，在細胞增殖、遷移及凋亡等生理過程中發揮重要作用［1，2］。近年研究表明，Gab2 在多數人類惡性腫瘤中表達增高，且Gab2 過表達促進腫瘤細胞增殖及遷移能力，進而影響腫瘤的進程。我們前期研究發現Gab2 在直腸癌組織中高表達，且其表達水平與臨床分期及淋巴結轉移密切相關［3］。本研究在此基礎上應用慢病毒載體感染人結直腸癌細胞SW480，初步觀察Gab2 過表達后對SW480 增殖和遷移能力的影響，從而在細胞水平闡明Gab2 的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人結直腸癌SW480 細胞株購自中科院上海細胞庫;Leibovitz's L-15 (L-15)培養基購自Gibco 公司;胎牛血清購自Hyclone 公司;含Gab2基因過表達的重組慢病毒顆粒由Cyagen 公司包被完成;Gab2 兔抗人單克隆抗體購自OriGene 公司，HRP 標記的山羊抗兔多克隆抗體、β-actin 小鼠抗人單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠多克隆抗體、ECL 發光液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天公司;全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司;Trizol 試劑、反轉錄試劑盒和qRT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與慢病毒感染 人結直腸癌SW480細胞培養于含10%胎牛血清的L-15 培養基中，培養條件為37℃、5%CO2飽和濕度。取對數生長期的SW480 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長融合約75%左右時，按慢病毒感染說明書進行感染。共分為3 組:以Gab2 基因過表達重組慢病毒顆粒(LV-Gab2-GFP)和對照慢病毒顆粒(LV-GFP)分別感染人結直腸癌SW480 細胞，作為實驗組(LV-Gab2-GFP 組)和陰性對照組(LV-GFP 組)，空白對照組細胞不作任何處理，常規培養。感染條件:每孔1 ml 培養基，含10%胎牛血清，109TU/ml 病毒液(10 μl)，polybrene 5 μg，感染8 h 后倒去培養基，加入2 ml 完全培養基，48 h 后更換完全培養基，熒光顯微鏡下觀察感染效率。大量擴增細胞，進入下一步實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞Gab2 mRNA 的表達 按照Trizol 說明書方法提取各組細胞總RNA，按反轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA，PCR 循環擴增。Gab2 上游引物:5'-GTGGGGGATCTGAATGTTTTTATG-3'，下游引物:5'-GCCCCAGGGTAGAATGAAACG-3';內參GAPDH 上游引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應條件:95℃預變性5 min;45 個循環，95℃20 s，60℃1 min;72℃延伸5 min。運用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達量。實驗重復3 次。

1.2.3 Western blot 檢測細胞Gab2 蛋白的表達 以細胞裂解液裂解提取各組細胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白含量。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉膜1.5 h，5% BSA 封閉1 h 后，分別加入Gab2 兔抗人單克隆抗體(1∶1 000)及β-actin 小鼠抗人單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜漂洗，加二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h 滴加發光試劑暗室曝光顯示條帶。

1.2.4 CCK-8 法檢測3 組細胞增殖的變化 參照CCK-8 試劑說明進行。分別取上述3 組細胞以4 ×103/孔的密度接種于96 孔培養板(100 μl/孔)，37℃、5% 的CO2條件下培養24 h 后，加入10 μl CCK-8 繼續孵育2 h 后，用酶標儀在450 nm 波長下檢測各孔的吸光度值。每隔24 h 檢測一次，每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.2.5 單細胞克隆形成實驗 將3 組細胞接種至6 孔板(400 個/孔)，置37℃、5%的CO2培養箱常規培養，連續15 d，終止培養后常規以PBS 緩沖液洗滌細胞，甲醛固定15 min，采用結晶紫染液染色后，在顯微鏡下計數細胞數＞50 個的細胞克隆，計算克隆形成率:克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.6 細胞劃痕實驗 將3 組細胞以每孔1 ×105接種于24 孔板中，放入37℃、5%的CO2培養箱常規培養。待細胞貼壁后，取一無菌1 ml 槍頭用其尖端分別在24 孔板各組細胞上垂直劃痕。PBS 清洗細胞去除劃下的細胞，加入完全培養基繼續培養，在24 h 后倒置相差顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷移情況并拍照。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS19.0 統計分析，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 感染SW480 細胞后熒光顯微鏡觀察感染效果 慢病毒載體感染SW480 細胞48 h 后，通過熒光強度判斷感染效果。倒置熒光顯微鏡觀察發現，感染后大部分細胞均有GFP 表達，感染效率達70%以上(圖1)。

2.2 Gab2 mRNA 在3 組細胞中的表達 RT-PCR檢測結果顯示，實驗組(LV-Gab2-GFP 組)的Gab2 mRNA 表達較另外兩組明顯增強，而陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組的Gab2 mRNA 表達均很弱，且兩組間無明顯差異性(圖2A)。

2.3 Gab2 蛋白在3 組細胞中的表達 Western blot檢測結果發現，實驗組(LV-Gab2-GFP 組)較陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組Gab2 蛋白表達水平明顯上調，而陰性對照組(LV-GFP 組)和空白對照組無顯著差異性(圖2B)。

2.4 Gab2 過表達對SW480 增殖的影響

2.4.1 CCK-8 檢測結果 培養24 h 時，3 組細胞的增殖速度均無明顯差異性(P ＞0.05);從48 h 到72 h 各個時間點，實驗組(LV-Gab2-GFP 組)的細胞增殖速度均明顯高于另外兩組(P＜0.05)，而陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組相比，各個時間點的細胞增殖速度均無明顯差異性(P ＞0.05)(圖3)。實驗結果表明Gab2 過表達能夠增強SW480 細胞的增殖能力。

圖1 慢病毒感染SW480 細胞熒光表達情況Fig.1 Lentivirus infection of SW480 cells and GFP expression

圖2 RT-PCR 和Western blot 檢測Gab2 在SW480 細胞中的表達Fig.2 Expression of Gab2 in SW480 cells were detected by RT-PCR and Western blot

圖3 Gab2 過表達對SW480 細胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of Gab2 overexpression on proliferation of SW480 cells

圖4 Gab2 過表達對SW480 細胞克隆形成的影響Fig.4 Effects of Gab2 overexpression on clone formation of SW480 cells

圖5 Gab2 過表達對SW480 細胞遷移能力的影響(SP，×40)Fig.5 Effects of Gab2 overexpression on migration of SW480 cells(SP，×40)

2.4.2 單細胞克隆形成結果 實驗組(LV-Gab2-GFP 組)細胞克隆形成率(85.10 ±5.38)%明顯高于陰性對照組(LV-GFP 組)細胞克隆形成率(51.13±10.46)%和空白對照組細胞克隆形成率(53.43±8.79)%，差異具有統計學意義(P＜0.01)，陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組之間差異不顯著(P ＞0.05)(圖4)。實驗結果表明Gab2 過表達能夠增強SW480 細胞克隆形成的能力。

2.5 Gab2 過表達對SW480 細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，實驗組(LV-Gab2-GFP 組)細胞遷移能力較另外兩組明顯增強(P＜0.05)，陰性對照組(LV-GFP 組)與空白對照組差異不明顯(P ＞0.05)(圖5)。實驗結果表明Gab2 過表達能夠增強SW480 細胞的遷移能力。

3 討論

結直腸癌的發病率逐年上升，現居全球癌癥的第4 位［4］。盡管目前治療手段多樣，但療效不盡人意，快的增長率和重要臟器的轉移是結直腸癌患者死亡的主要原因。因此，與結直腸癌增殖及轉移相關的生物學標志是目前結直腸癌研究的熱點問題。

Gabs 家族蛋白(Grb2-associated binder family proteins)是一類廣泛表達的支架蛋白，該家族成員包括哺乳動物內Gab1～Gab4，果蠅屬DOS，海葵內Ne-Gab 及秀麗線蟲內Soc1［1］。Gab2 作為Gabs 家族的重要成員之一，主要介導SHP2/ERK 途徑和PI3K/AKT 途徑，對細胞增殖、分化、粘附及遷移等生物學功能至關重要［1］。近些年來，隨著對Gab2研究的不斷深入，Gab2 在多種惡性腫瘤中所發揮的作用正逐漸被揭示，Gab2 可能作為一種致癌基因，在不同的腫瘤中發揮關鍵調節作用。在乳腺癌中，Gab2 蛋白和ErbB2 (Neu，HER2)表達同時增高時，通過Gab2 介導的SHP2/ERK 信號通路提高乳腺腫瘤的惡性程度及腫瘤細胞的侵襲能力［5］。Wohrle等［6］發現，Gab2 通過SHP2/RAS/ERK 及PI3K/AKT/mTOR 信號通路，可以增強慢性粒細胞白血病(CML)細胞的增殖和存活能力，而敲除Gab2 基因會明顯抑制細胞增殖和存活。另外，在NRAS 突變誘導的黑色素瘤中，Gab2 通過激活RAS/ERK 信號通路，促進黑色素瘤細胞增殖及腫瘤血管的生成［7］。研究表明，在卵巢癌中通過激活PI3K/Zeb1通路，Gab2 過表達啟動了上皮間質轉換(Epithelialto-mesenchymal transition，EMT)程序，抑制了E-ca的表達，從而增加腫瘤細胞遷移和侵襲能力［8］。Dunn 等［9］也發現，Gab2 可以作為卵巢癌的一種致癌基因，可通過活化PI3K 信號途徑誘導卵巢癌細胞發生轉變。除此之外，Gab2 在肺癌、神經膠質瘤及胃癌中表達異常，并與腫瘤進程密切相關［10-12］。

本研究通過Gab2 基因的重組慢病毒顆粒(LVGab2-GFP)感染人結直腸癌SW480 細胞，觀察Gab2過表達對細胞增殖和遷移能力的影響。我們發現LV-Gab2-GFP 慢病毒載體能夠被高效的感染SW480 細胞，并在SW480 細胞過表達Gab2 mRNA和蛋白。進一步研究結果顯示，過表達Gab2 的SW480 細胞增殖和遷移能力顯著增強。提示Gab2在人結直腸癌細胞增殖及轉移過程中發揮了重要作用，但Gab2 促進人結直腸癌細胞增殖和遷移的作用機制需要作進一步深入研究。

綜上所述，Gab2 在人類多種惡性腫瘤的增殖、遷移及浸潤過程中扮演了重要角色。本研究初步證實了Gab2 過表達能夠促進人結直腸癌SW480 細胞增殖和克隆形成，并增強細胞遷移能力。這些提示Gab2 可能作為一個新的結直腸癌的癌基因被用于結直腸癌的早期診斷與治療，也為進一步研究Gab2的生物學功能及其作用分子機制提供基礎理論依據。

［1］Wohrle F U，Daly R J，Brummer T.Function，regulation and pathological roles of the Gab/DOS docking proteins［J］.Cell Commun Signal，2009，7(22):10.1186.

［2］Nakaoka Y，Komuro I.Gab docking proteins in cardiovascular disease，cancer，and inflammation ［J］.Int J Inflam，2013，2013:141068.

［3］丁陳波，馮繼紅，于偉娜，等.Gab2 在結直腸癌組織中的表達及其意義［J］.中國免疫學雜志，2015，31(2):160-162.

［4］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63(1):11-30.

［5］Bentires-Alj M，Gil SG，Chan R，et al.A role for the scaffolding adapter GAB2 in breast cancer ［J］.Nat Med，2006，12(1):114-121.

［6］Wohrle F U，Halbach S，Aumann K，et al.Gab2 signaling in chronic myeloid leukemia cells confers resistance to multiple Bcr-Abl inhibitors［J］.Leukemia，2013，27(1):118-129.

［7］Yang Y，Wu J，Demir A，et al.GAB2 induces tumor angiogenesis in NRAS-driven melanoma ［J］.Oncogene，2013，32 (31):3627-3637.

［8］Wang Y，Sheng Q，Spillman MA，et al.Gab2 regulates the migratory behaviors and E-cadherin expression via activation of the PI3K pathway in ovarian cancer cells［J］.Oncogene，2012，31(20):2512-2520.

［9］Dunn G P，Cheung H W，Agarwalla P K，et al.In vivo multiplexed interrogation of amplified genes identifies GAB2 as an ovarian cancer oncogene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(3):1102-1107.

［10］Zhang X，Zhang Y，Tao B，et al.Docking protein Gab2 regulates mucin expression and goblet cell hyperplasia through TYK2/STAT6 pathway［J］.FASEB J，2012，26(11):4603-4613.

［11］Shi L，Sun X，Zhang J，et al.Gab2 expression in glioma and its implications for tumor invasion［J］.Acta Oncol，2013，52(8):1739-1750.

［12］Lee SH，Jeong EG，Nam SW，et al.Increased expression of Gab2，a scaffolding adaptor of the tyrosine kinase signalling，in gastric carcinomas［J］.Pathology，2007，39(3):326-329.