雞蛋白提取液誘導細胞后干細胞蛋白芯片分析①

阮光萍 姚 翔 劉菊芬 王金祥 李自安 胡媛媛 潘興華

(成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心，昆明 650032)

發現一種提取液能促進體細胞向干細胞轉變將在再生醫學研究中有重要的意義。有文獻報道動物的卵細胞提取液能重新編程體細胞，包括豬的卵細胞［1］和非洲爪蟾的卵細胞［2，3］提取液都能使體細胞核重編程。在這個研究中，我們用雞蛋白提取液作用于不同細胞，共培養3 d 后，收集細胞，送公司做干細胞蛋白芯片檢測，現將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 4 種細胞為我們實驗室經常培養的細胞，C57 小鼠的骨髓間充質干細胞(C57-BMSC)(自己制備)，樹鼩的臍帶間充質干細胞(TS-UCMSC)(自己制備)，293T 細胞(購自中國科學院昆明細胞庫)和GFP 慢病毒轉染成功的293T 細胞(293T-GFP)(自己轉染成功)。

1.2 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1∶1 加裂解液，充分攪勻，存放于-20℃。凍融3 次后，離心，取上清，4℃保存。裂解液配方:50 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L HEPES，pH8.2，1 mmol/L 二 硫 蘇 糖 醇(DTT)，0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液用50%的終濃度與293T 細胞共培養3 d，然后用定量PCR 的方法檢測細胞多能基因OCT4和NANOG 與對照(培養基培養)相比明顯升高，即為質控指標合格，可用于下面的實驗。

1.3 干細胞蛋白芯片檢測步驟 每個芯片孔中加入100 μl 的1 ×封閉液，室溫搖床上孵育30 min，避免產生氣泡;抽去封閉液，每個孔中添加100 μl 樣品，一個陣列一個樣品;4 ℃振蕩過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機清洗玻片，每孔加入70 μl 生物素標記抗體;室溫震蕩孵育1～2 h，清洗，每孔加入70 μl 的1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育1～2 h。清洗，采用激光掃描儀例如Axon GenePix 掃描信號。采用芯片分析軟件提取數據，對于Fold change，選取大于1.5 為有統計學意義。

1.4 Western blot 檢測多能標志蛋白OCT4 和NANOG 兔抗人OCT4 多克隆抗體購自Immunoaway 公司，鼠抗人NANOG 單克隆抗體購自Millipore公司，二抗均購自碧云天生物技術有限公司。293T細胞在6 孔板中，一孔加培養基，一孔加50%終濃度的雞蛋白提取液，共培養3 d 后，用碧云天的IP細胞裂解液提細胞蛋白，取50 μl 細胞蛋白液加10 μl 6 ×的上樣緩沖液，100℃水浴5 min，上樣20 μl，進行SDS-PAGE 電泳，電泳結束后，100 v 電壓轉膜1 h，膜用5%脫脂奶粉的TBS 封閉37℃1 h，將一抗1∶250 稀釋于2%脫脂奶粉的TBS 中，37℃振搖1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，二抗1∶200 稀釋于2%脫脂奶粉的TBS 中，37℃振搖1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，ECL 顯色，用Tanon 的化學發光成像儀檢測發光條帶。

2 結果

2.1 C57-BMSC 有3 個蛋白發生了統計學意義的改變 SOX17、BMPR-1A 和NANOG 是干細胞中表達的蛋白，當體細胞向干細胞轉變后細胞中這幾個蛋白的表達升高，我們用50%終濃度的雞蛋白提取液與C57-BMSC 共培養3 d 后，這幾個蛋白的表達明顯升高，說明C57-BMSC 又向更多能的干細胞分化了，見圖1。

2.2 TS-UC-MSC 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變 BMPR-1A 是干細胞多能性的標志，TS-UCMSC 用50%雞蛋白提取液共培養3 d 后，與未加雞蛋白提取液培養的細胞相比，BMPR-1A 明顯升高，說明細胞又向多能干細胞的方向分化了，見圖2。

2.3 293T 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變 BMPR-1A 是干細胞多能性的標志，293T 細胞是標準的體細胞株，用50%雞蛋白提取液共培養3 d 后，BMPR-1A 表達明顯升高，說明293T 細胞有向干細胞轉變的現象發生，見圖3。

2.4 293T-GFP 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變 OCT4 是干細胞多能性的標志，293T-GFP 用50%的雞蛋白提取液共培養后，對比培養基培養的細胞OCT4 的表達明顯增加，說明細胞有向干細胞轉化的現象。

圖1 C57-BMSC 有3 個蛋白發生了統計學意義的改變(n=3)Fig.1 C57-BMSC has three proteins occurred statistically significant change(n=3)

圖2 TS-UC-MSC 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變(n=3)Fig.2 TS-UC-MSC has one protein occurred statistically significant change(n=3)

圖3 293T 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變(n=3)Fig.3 293T has one protein occurred statistically significant change(n=3)

2.5 293T 細胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 結果(圖5) OCT4 和NANOG 蛋白是干細胞多能性的標志，293T 細胞用50%的雞蛋白提取液共培養后，OCT4 和NANOG 蛋白的表達量明顯增加(圖5 和表1)，與對照組(培養基培養)相比有統計學意義(P＜0.05，n=3)。

圖4 293T-GFP 有1 個蛋白發生了統計學意義的改變(n=3)Fig.4 293T-GFP has one protein occurred statistically significant change(n=3)

圖5 293T 細胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 結果Fig.5 Western blot results of OCT4 and NANOG protein in 293T cells

3 討論

SOX17、BMPR-1A、NANOG 和OCT4 是干細胞中表達的蛋白，在細胞轉化為多能的干細胞時，這幾個蛋白的表達明顯升高。因此，這些蛋白在細胞中表達明顯升高時，可以認為細胞向多能的干細胞發生了轉化。

表1 293T 細胞誘導后OCT4 和NANOG 蛋白的相對表達量(n=3)Tab.1 OCT4 and NANOG protein relative expression in induced 293T cells(n=3)

我們用共培養法發現加了50%雞蛋白提取液的細胞有一些干細胞蛋白表達明顯升高，而現在用卵細胞提取液誘導體細胞核重編程的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素O(SLO)在細胞膜上打孔，再用卵細胞提取液滲透，最后再用氯化鈣再封合細胞膜上的孔，是否這種方法誘導效率更高，需要今后的實驗進一步深入研究。

我們在實驗中用了4 種細胞，C57 小鼠的骨髓間充質干細胞(C57-BMSC)、樹鼩的臍帶間充質干細胞(TS-UC-MSC)、293T 細胞(購自中國科學院昆明細胞庫)和GFP 慢病毒轉染成功的293T 細胞(293T-GFP)，用50% 的雞蛋白提取液共培養3 d后，均檢測到了干細胞相關蛋白表達的升高，說明了雞蛋白提取液有誘導細胞向多能干細胞轉變的現象，因為多能標志蛋白有意義地升高了。

對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細胞培養，有較大的應用價值。在我們以前的研究中，發現雞蛋白提取液有促細胞增殖的作用［4，5］，還有促進多能因子OCT4 和NANOG 升高表達的作用［6，7］，因此在本研究中我們進一步應用干細胞蛋白芯片檢測更多的多能因子，同時使用4 種細胞，都檢測到其中多能因子的升高表達，C57-BMSC 有SOX17、BMPR-1A 和NANOG 這3 個蛋白發生了統計學意義的改變，TS-UC-MSC 有BMPR-1A 蛋白發生了統計學意義的改變，293T 有BMPR-1A 蛋白發生了統計學意義的改變，293T-GFP 有OCT4 蛋白發生了統計學意義的改變，進一步驗證了雞蛋白提取液有誘導體細胞向多能細胞轉變的作用。

由于C57-BMSC 和TS-UC-MSC 是間充質干細胞，它們經過誘導后多能因子進一步升高表達，是否證明了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細胞的特殊物質，以及這些物質的鑒定和分離提取還有待實驗進一步驗證。

［1］Miyamoto K，Tsukiyama T，Yang Y，et al.Cell-free extracts from mammalian oocytes partially induce nuclear reprogramming in somatic cells［J］.Biol Reprod，2009，80(5):935-943.

［2］Hansis C，Barreto G，Maltry N，et al.Nuclear reprogramming of human somatic cells by xenopus egg extract requires BRG1［J］.Curr Biol，2004，14(16):1475-1480.

［3］Miyamoto K，Furusawa T，Ohnuki M，et al.Reprogramming events of mammalian somatic cells induced by Xenopus laevis egg extracts［J］.Mol Reprod Dev，2007，74(10):1268-1277.

［4］阮光萍，王金祥，劉菊芬，等.雞卵清提取液中小于3kDa 的成分有促細胞增殖的作用［J］.中國細胞生物學學報，2014，36(10):1350-1354.

［5］阮光萍，王金祥，龐榮清，等.雞卵細胞提取液有維持和增強細胞活性的關鍵作用［J］.中國細胞生物學學報，2013，35(6):804-809.

［6］阮光萍，王金祥，姚 翔，等.雞卵提取物促進293T 細胞升高表達多能基因OCT4 和NANOG［J］.中國細胞生物學學報，2014，36(2):190-194.

［7］阮光萍，姚翔，劉菊芬，等.雞卵清提取液中大于3ku 蛋白促細胞升高表達多能基因Oct-3/4 和Nanog［J］.中國組織工程研究，2014，18(37):6029-6033.