多巴胺能神經營養因子真核表達、純化及多克隆抗體制備①

王立正 王子璇 朱 瑞 劉鎮天 于 彬 于湘暉 趙興紅

(吉林大學生命科學學院艾滋病疫苗國家工程實驗室，長春 130012)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是目前世界上第二大神經退行性疾病，在50 歲以上人群中患病率顯著上升［1-3］。PD 最重要的病理特征是黑質致密部多巴能神經元大量減少［4］。神經營養因子是一類能促進神經元生長并對其有保護作用的分泌性蛋白，近年來大多數被證明對多巴胺能神經元具有保護作用，并在動物實驗結果中得到證明［5，6］。腦多巴胺能神經營養因子(Cerebral dopamine neurotrophic factor，CDNF)是屬于MANF 家族的一類神經營養因子［7］，于2007 年由Lindholm 等［8］首次發現，并在動物水平上說明CDNF 蛋白可以保護及修復多巴胺能神經元，具有治療帕金森病的應用前景。

本研究通過構建真核表達質粒pVR1012-CDNF-his，轉染至真核細胞HEK 293T 中進行蛋白表達，收取上清進行鎳柱親和層析純化，以獲得純度較高的CDNF 蛋白。為方便進一步對CDNF 功能機制及其在帕金森病中的應用進行研究。使用純化的蛋白免疫動物，制備出特異性較好的多克隆抗體，方便之后研究中CDNF 蛋白的鑒定及發揮生物功能過程中與其他蛋白相互作用探究。

1 材料與方法

1.1 材料 VR1012 載體及pAAV-CDNF 質粒為本實驗室保存;SalⅠ限制性內切酶、BamHⅠ限制性內切酶及T4 連接酶購自TaKaRa 公司;CDNF 多抗購自Abcam 公司;Ni-NTA agarose、預染蛋白Marker 及Anti-his 單抗購自Invitrogen 公司;MTT 購自Biosharp 公司;DMEM 細胞培養液及小牛血清白蛋白(FBS)購自Hyclone 公司;NBT、BCIP、AP 標記山羊抗兔IgG 及AP 標記山羊抗鼠IgG 購自鼎國生物科技有限責任公司。

1.2 pVR1012-CDNF-his 構建 使用引物(正向引物:5'-CCTAGCGTCGACATGTGGTGCGCGAGCCC-3';反向引物:5'-GTAATGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGCTCTGTTTTGGGGTG-3')，以pAA V-CDNF 為模板通過PCR 擴增出帶有his 標簽堿基序列的CDNF-his 目的片段。具體PCR 程序設置為:98℃下預變性5 min;進入30 個循環的擴增程序:98℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min;30 個循環程序結束后72℃再延伸10 min;最后降溫至4℃完成PCR。擴增出的目的片段兩端帶有SalⅠ及BamHⅠ兩個限制性內切酶酶切位點。按照酶切、膠回收、連接、轉化、挑單克隆、質粒抽提等步驟，構建pVR1012-CDNF-his。

1.3 CDNF 真核表達 預先傳代HEK 293T 細胞，待細胞生長至細胞培養瓶底面積的70%～80%時，換成不含FBS 的DMEM 培養基，使用PEI 為轉染試劑，將pVR1012-CDNF-his 質粒轉入細胞，4～6 h 后換成含10% FBS 的DMEM 培養基，72 h 后收取上清進行純化。

1.4 CDNF 純化、SDS-PAGE 檢測及Western blot 鑒定 收取的上清過0.45 μm 濾膜后進行鎳柱親和層析，摸索洗脫條件，最終確定使用25、50、70、90 mmol/L 咪唑濃度洗脫液按照從低咪唑濃度到高咪唑濃度對CNDF-his 蛋白梯度洗脫。SDS-PAGE 檢測蛋白純度，考馬斯亮藍染色結果用Quantity one 進行灰度分析，估算目的蛋白純度。Western blot 對蛋白進行鑒定。

1.5 MTT 法檢測CDNF 蛋白生物活性 96 孔板中按照1 ×105個細胞/孔鋪PC12 細胞，含2% FBS 的DMEM 培養基培養12 h 后，換成不含FBS 的DMEM培養基，6-OHDA 加入孔中，同時加入CDNF 蛋白使得最終每孔中6-OHDA 濃度為200 μmol/L，CDNF蛋白濃度呈系列梯度，孵育24 h，加入MTT，孵育4 h，酶標儀單波長OD490nm 進行讀板。導出數據，分析。

1.6 多克隆抗體制備及鑒定 選取3 月齡健康新西蘭大白兔，免疫前取2 ml 血制備血清做陰性對照，-80℃保存。初次免疫使用500 μg 蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合液，間隔兩周后進行第二次免疫，使用200 μg 蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合液，再間隔三周使用200 μg 蛋白與弗氏不完全佐劑等比混合液進行第三次免疫，1 周后心臟采血制備血清通過Western blot 鑒定多克隆抗體。免疫時注射方法為背部多點注射。采用的血清制備方法為:全血4℃放置過夜，4℃離心機3 000 r/min 離心20 min 后吸取上清至新的離心管，再次4℃離心機3 000 r/min 離心20 min，收取上清即獲得血清。

2 結果

2.1 pVR1012-CDNF-his 構建 按照圖1 所示設計構建質粒，構建得到質粒進行雙酶切鑒定，結果顯示成功將目的片段構建入載體。進行測序，結果顯示目的片段無突變，完全與預期序列匹配。

2.2 CDNF 蛋白純化SDS-PAGE 分析及Western blot 鑒定 CDNF 蛋白在20 個細胞培養瓶(225 cm2)的HEK 293T 細胞中(總培養基量為500 ml)大量表達之后，收取上清進行鎳柱親和層析，蛋白與鎳柱結合后，摸索洗脫條件，SDS-PAGE 結果顯示(見圖2)，在50 mmol/L 咪唑濃度的洗脫液洗脫時已經可以洗脫下目的蛋白。對電泳條帶進行灰度分析，結果顯示70 mmol/L 及90 mmol/L 咪唑濃度洗脫液洗脫得到的蛋白純度在90%以上。最終將蛋白濃縮至約1 mg/ml 的濃度，分裝后-80℃保存。500 ml 上清可以純化出約1 mg 蛋白。使用Western blot 對純化的蛋白進行鑒定，結果顯示(見圖3)，所獲得的CDNF 蛋白正確性得到驗證。

圖1 pVR1012-CDNF-his 圖譜及質粒酶切鑒定分析Fig.1 pVR1012-CDNF-his map and plasmid's restriction enzyme digestion analysis

圖2 SDS-PAGE 分析蛋白純化情況Fig.2 SDS-PAGE analysis for protein purification

圖3 純化得到的CDNF 蛋白Western blot 鑒定Fig.3 Western blot analysis for CDNF protein after purification

2.3 CDNF 生物活性鑒定 通過實驗摸索6-OHDA在200 μmol/L 濃度下對PC12 細胞能起到較好的殺傷效果，因此選擇此濃度作為殺傷濃度，評價純化得到的CDNF 對PC12 是否具有保護作用。MTT 結果顯示(見圖4)，隨著CDNF 濃度的升高，PC12 細胞存活率呈上升趨勢，說明所純化獲得的蛋白具有良好的生物活性。

2.4 多克隆抗體鑒定 免疫過程中及免疫后取血制備血清，使用Western blot 來檢測多克隆抗體。結果顯示(見圖5):二免后新西蘭兔體內已產生CDNF 特異性抗體，三免起到了免疫加強效果，兔體內產生了更多的多克隆抗體。因此，CDNF 兔多克隆抗體成功制備。

3 討論

CDNF 作為一種近年來發現的新型神經營養因子對多巴胺能神經元具有保護作用，因此具有治療帕金森病的良好前景。在對其進行研究過程中，一般均通過昆蟲桿狀病毒表達系統進行表達及后續純化［8，11］。桿狀病毒表達系統具有表達量高且質量好(可一定程度保證蛋白正確折疊及糖基化修飾等)以及可放大生產等優點［9，10］。但目前市售的桿狀病毒表達試劑盒價格較高，且一般實驗室研究蛋白需求量較小，所以桿狀病毒表達系統用于純化蛋白不適用于常規實驗室。本研究旨在探索出一種成本較低，適合于“蛋白需求量小”的蛋白表達純化體系，使用該體系獲得具有生物活性的CDNF 蛋白。

圖4 CDNF 生物活性鑒定MTT 結果Fig.4 MTT results for biological activity identification

圖5 多克隆抗體Western blot 檢測結果Fig.5 Western blot for polyclonal antibodies analysis

HEK 293T 細胞是常用的哺乳動物細胞，且表達質粒轉染后表達效果較好。鎳柱親和層析是攜帶有his 標簽蛋白的常用純化手段。因此本研究聯合“HEK 293T 細胞表達蛋白”與“鎳柱親和層析”，進行目的蛋白CDNF 的表達純化。首先，從本實驗室已有的pAAV-CDNF 上通過PCR 手段擴增出CDNF表達序列:3'端帶有6 ×his 標簽序列的片段，進而構建入VR1012 真核表達載體，在真核細胞HEK 293T中成功大量表達出C 端帶有6 ×his 標簽的CDNF蛋白。同時，由于構建入載體的CDNF 基因片段5'端具有調控表達蛋白分泌的信號肽，故細胞內存在未剪切信號肽的未成熟CDNF 蛋白及剪切掉信號肽的成熟CDNF 蛋白兩種形式。為只獲得成熟的CDNF 蛋白，故只收取上清進行鎳柱親和層析，獲得了純度較高的成熟的CDNF 蛋白。

有研究報道，CDNF 在6-OHDA 介導的PC12 損傷過程中通過抑制影響Caspase 3 及Bcl-2/Bax 相關的凋亡通路或抑制JNK 信號通路起到保護多巴胺能神經元的作用［11，12］。基于此，采用MTT 法檢驗純化獲得的蛋白對神經細胞是否具有保護作用。因此，采用MTT 法檢驗純化獲得的蛋白是否具有保護作用。MTT 結果顯示，獲得的CDNF 蛋白對PC12細胞具有很好的保護效果。

若進一步研究CDNF 在帕金森病等疾病中的應用或對其相關機理進行研究，CDNF 的抗體必不可少。若將CDNF 蛋白應用到帕金森病的治療中，CDNF 在腦部的含量及分布情況需要通過WB 或免疫組織化學染色的方法進行分析，這兩種方法必不可少CDNF 的抗體［8，13，14］;若研究CDNF 蛋白的保護機理，CDNF 的抗體則可用于一系列含有CDNF目的片段的重組質粒的表達鑒定及用于探究CDNF相互作用蛋白的實驗中。因此，本文獲得純度較高的CDNF 蛋白后，用其免疫動物，成功刺激新西蘭大白兔產生特異性抗體，經Western blot 進行鑒定，制備獲得的多克隆抗體與CDNF 蛋白具有很好的結合特異性，且在1∶1 000 使用時獲得較好的蛋白顯色效果。至此，CNDF 蛋白的兔多克隆抗體成功制備。

綜上所述，本研究成功建立相比較桿狀病毒表達系統成本較低、操作較簡單、更適用于實驗室研究的“HEK 293T 細胞表達，鎳柱親和層析純化”的蛋白表達純化體系，獲得具有生物活性的CDNF 蛋白，并成功制備了特異性較好的CDNF 多克隆抗體。為進一步研究CDNF 的功能、應用及保護機制等方面奠定了基礎。

［1］Olanow，C.W，Stern，M.B.and Sethi，K，et al.Incidence of Parkinson's disease:variation by age，gender，and race/ethnicity［J］.Am J Epidemiol，2003，157(11):1015-1022.

［2］Olanow CW，Stern MB，Sethi K.The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease［J］.Neurology，2009，72(21 Suppl 4):S1-S136.

［3］Calabrese VP.Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations，2005 through 2030［J］.Neurology，2007，69(2):223-224.

［4］Welchko RM，Leveque XT，Dunbar GL，et al.Genetic rat models of Parkinson's disease［J］.Parkinsons Dis，2012，2012:128356.

［5］Ciesielska A，Mittermeyer G，Hadaczek P，et al.Anterograde axonal transport of AAV2-GDNF in rat basal ganglia［J］.Mol Ther，2011，19(5):922-927.

［6］Allen SJ，Watson JJ，Shoemark DK，et al.GDNF，NGF and BDNF as therapeutic options for neurodegeneration［J］.Pharmacol Ther，2013，138(2):155-175.

［7］Lindholm P，Saarma M.Novel CDNF/MANF family of neurotrophic factors［J］.Dev Neurobiol，2010，70(5):360-371.

［8］Lindholm P，Voutilainen MH，Lauren J，et al.Novel neurotrophic factor CDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo［J］.Nature，2007，448(7149):73-77.

［9］Richard B，Hitchman，Robert D，et al.Baculovirus expression systems for recombinant protein production in insect cells［J］.Recent Patents Biotechnol，2009，3:46-54.

［10］Ailor E，Betenbaugh MJ.Modifying secretion and posttranslational processing in insect cells［J］.Curr Opin Biotechno，1999，10(2):142-145.

［11］Mei JM，Niu CS.Effects of CDNF on 6-OHDA-induced apoptosis in PC12 cells via modulation of Bcl-2/Bax and caspase-3 activation［J］.Neurol Sci，2014，35(8):1275-1280.

［12］Zhao H，Cheng L，Liu Y，et al.Mechanisms of anti-inflammatory property of conserved dopamine neurotrophic factor:inhibition of JNK signaling in lipopolysaccharide-induced microglia［J］.J Mol Neurosci，2014，52(2):186-192.

［13］Merja H.Voutilainen，Susanne B?ck，Johan Per?nen，et al.Chronic infusion of CDNF prevents 6-OHDA-induced deficits in a rat model of Parkinson' s disease［J］.Exp Neurol，2011，228:99-108.

［14］Ren X，Zhang T，Gong X，et al.AAV2-mediated striatum delivery of human CDNF prevents the deterioration of midbrain dopamine neurons in a 6-hydroxydopamine induced parkinsonian rat model［J］.Exp Neurol，2013，248:148-156.