新疆石河子地區漢族人群HLA-DPB1 基因多態性與肺結核易感的相關性研究①

盧麗君 吳江東 左維澤 張萬江 章 樂 吳 芳

(石河子大學新疆地方病與民族高發病教育部重點實驗室，石河子 832000)

肺結核是本世紀威脅人類健康的主要傳染病，全球有約1/3 的人感染結核分枝桿菌，在不發達和發展中國家尤為嚴重，國內形勢也不容樂觀。全國第5 次結核病流行病學抽樣調查顯示我國活動性肺結核患病率459/10 萬［1］。所感染人群，約10%的人可發展成活動性肺結核，提示可能有相關基因參與疾病的發生發展。近年來，國內外已有大量研究顯示肺結核與白細胞分化抗原(HLA)Ⅱ類基因密切相關。

HLA 位于人類第六號染色體的短臂，長約3 600 kb，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，其中HLA Ⅱ類可分為HLA-DR、HLA-DQ 和HLA-DP 區，HLA-DQ 和HLA-DR 基因與肺結核的相關性國內外學者已進行了廣泛研究，而HLA-DP 也開始受到關注。1978 年Wank 等預處理淋巴細胞分型(Primed lymphocyte typing，PLT)時發現DR、DQ 不一樣的新抗原，使預處理T 淋巴細胞產生很強的二次反應，導致后來HLA-DP 抗原的發現。到目前為止IMGT/HLA 數據庫經WHO 確認報道的HLA-DPB1 等位基因已有489 個(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/docs/release.html，2015，2.5)。HLA-DP 是表達于B 細胞、抗原提呈細胞和激活的T 細胞表面的糖蛋白。DP 分子是異二聚體，由一條α 鏈和β 鏈組成，后者具有高度多態性。迄今為止，國外僅有印度南部研究顯示HLA-DPB1* 04 與肺結核密切相關，具有預防及保護性作用［2，3］，國內暫無HLA-DPB1 與肺結核相關性的研究。為此，本研究采用SBT 方法從群體遺傳學及分子遺傳學角度分析新疆石河子地區漢族肺結核患者與HLA-DPB1 等位基因的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例組為2014 年3 月至2014 年9 月石河子大學醫學院第一附屬醫院感染科門診和住院部的肺結核患者，共93 例，均符合肺結核的診斷標準。收集其相關資料并與其簽署知情同意書。其中男58 例，女35 例;年齡16～85 歲，平均(46.1±13.5)歲。健康對照組為肺結核患者周圍環境同時期進行健康體檢的人群。共96 例，已排除其他各類慢性疾病，其中男70 例，女26 例;年齡20～78歲，平均(41.3 ±10.6)歲。對照組與病例組按性別和年齡(±5 歲)配比選取，兩組間性別、年齡差異均無統計學意義(P ＞0.05)。所選研究對象在新疆生活均超過20 年，祖籍以河南(27.3%)、甘肅(21.5%)、陜西(12.0%)和山東(10.8%)為主，個體之間無血緣關系。

1.2 方法 DNA 的提取:抽取病例組和對照組人群外周靜脈血3 ml，EDTA 抗凝，用天根公司DNA提取試劑盒(the mini column whole blood DNA extraction kit from tiangen)提取基因組DNA 。用紫外分光光度計測定DNA 濃度和純度，根據A260/A280 值計算DNA 提取的純度。

HLA-DPB1 等位基因檢測:HLA-DPB1 基因分型采用美國Invitrogen 公司(美國life technologiest公司產品)SeCoreTMHLA 測序試劑盒［5351925，SeCore DPB1 Locus Sequencing Kit，Group Specific Set(RUO)］，其中HLA-DPB1 基因檢測2 號外顯子正向反向測序。操作步驟:首先PCR 擴增、產物經酶切純化后作為測序反應模版，按照試劑盒操作進行測序反應利用ABI 3730 DNA 測序儀進行電泳分析。采用uTYPE Dx 序列分析軟件指定型別。樣本分型均在國家認證實驗室采用標準化分型方法，操作依據國際認證試劑盒按照說明書，經專業人員進行分型分析，實驗中采用雙盲對照方法，隨機重復實驗樣本，來檢查實驗的準確性。

1.3 統計學方法 采用Arlequin3.5 檢驗分析Hardy-Weinberg 平衡。采用SPSS17.0 以χ2檢驗比較各等位基因頻率在不同組之間的差異，對于頻數小于5 的采用fisher 確切指定方法計算。以比值比(OR)及其95%可信區間(CI)表示各等位基因攜帶個體發生肺結核的風險度。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗。以P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組等位基因分布情況及Hardy-Weinberg 平衡檢驗 自93 例新疆石河子地區漢族肺結核患者和96 例新疆石河子地區漢族健康對照個體的HLA-DPB1 基因外顯子二核酸序列通過與HLA-DPB1 基因型數據庫比較分析，共檢出有16 種HLA-DPB1 等位基因型別。其中以DPB1* 0501 等位基因的頻率最高。病例組占38.2%，對照組占28.1%。其次為DPB1* 0201(16.7%;27.6%)。另一個頻率較高的等位基因為DPB1 * 0401(17.1%;15.1%)，在新疆漢族人群中這三個基因超過DPB1 等位基因的70%。其余基因頻率為0.5%～5.0%，其中對照組中有四個等位基因在病例組中未檢出來，詳見表2。病例組和對照組的HLA-DPB1等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，見表1。

表1 病例組和對照組HLA-DPB1 的Hardy-Weinberg 平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium for HLA-DPB1 in patients and controls

表2 在肺結核病例組和健康對照組中HLA-DPB1 等位基因的頻率Tab.2 Frequencies of HLA-DPB1 alleles in patients and controls

2.2 病例組與對照組基因頻率對比及差異性比較在新疆石河子地區漢族肺結核患者與新疆石河子地區漢族健康對照組中的HLA-DPB1 等位基因頻率見表2?？捎^察出對照組中HLA-DPB1* 0201 等位基因頻率明顯高于病例組(27.6% vs 16.7%，OR=0.525，P=0.011);而HLA-DPB1* 0501 在病例組的頻率顯著高于對照組(38.2% vs 28.1%，OR=1.578，P=0.038)。檢出的其余等位基因在病例組與對照組中頻率分布無顯著統計學差異。

3 討論

HLA 基因在機體免疫調節中作用重大，尤其是HLA-Ⅱ類分子是在T 細胞介導的細胞免疫中所必需的分子，它主要參與了抗原肽的特異結合，并將之呈遞給CD4+T 細胞，形成MHC-抗原-T 細胞復合物，進而引起機體免疫反應。由于它在免疫反應中的重要性和自身的高度多態性，HLA 基因在疾病相關性研究中日益受到重視，尤其是HLA-Ⅱ類基因。已有研究發現HLA 系統與500 余種疾病的發生、發展有關，并且在器官移植中應用廣泛。

近20 年來，國內外已對多個種族和地區的人群HLA-Ⅱ類等位基因頻率進行了群體遺傳學分析，并在此基礎上研究HLA 基因型別與疾病的關聯，獲得了很多有意義的資料。

在中華人民共和國建國前，新疆長期居住的漢族人群極少，自解放來，響應黨中央“建設大西北”號召，來自五湖四海的漢族人群構成了新疆漢族人群的基礎，而石河子地區位屬北疆，又是兵團城市，漢族人群居多，依據我們采集樣本數據分析，此地區漢族人群祖籍多以河南、甘肅、陜西、山東等地為主。由于長期受新疆獨特的氣候、地理環境、生活方式等影響，為了適應環境，新疆漢族人群經過幾十年的融合變遷，HLA-DPB1 等位基因有了頻率分布的自身特點，但仍然偏北方人群。

本研究對照組數據顯示HLA-DPB1* 0501(28.1%)、HLA-DPB1* 0201(27.6%)、HLA-DPB1*0401(15.1%)是新疆石河子地區漢族人群的高頻基因，之前有文獻報道我國其他地區漢族人群HLADPB1 頻率分布情況，關于新疆漢族人群卻未見報道，依據HLA 頻率分布趨勢，我國漢族人群可分為南北兩大群體。北方地區(如沈陽、山東35%左右)HLA-DPB1* 0501 頻率普遍低于南方地區(如四川、浙江、廣東40%左右)，呈北低南高的趨勢;而HLADPB1* 0201 的頻率則是北方(如沈陽、山東20%左右)高于南方(如浙江、四川、廣東15%左右)，呈北高南低的趨勢，HLA-DPB1* 0401 及其他基因無明顯分布規律［4-7］。新疆哈薩克族與維吾爾族人群的HLA-DPB1 基因與新疆漢族人群相比較，HLA-DPB1* 0401 所占比例最大(哈薩克族21.4%;維吾爾族31.6%)，而HLA-DPB1* 0501 比例卻明顯降低(哈薩克族20.2%;維吾爾族7.0%)［8，9］。亞洲其他國家(如韓國、日本)人群HLA-DPB1 基因與中國新疆漢族相比較，前三位HLA-DPB1* 0501、0201、0401所占比例大體一致，HLA-DPB1* 0402 基因在中國漢族所占比例很小，基本在10%以下，而在韓國、日本卻占10%以上［10，11］。本研究所選研究對象皆是在新疆石河子生活超過20 年的漢族人群，具有一定的代表性，本研究可為新疆本地漢族的人類學及疾病相關性研究提供依據和參考。

HLA-Ⅱ類分子主要參與外源性抗原的傳遞，是與結核分枝桿菌相關性最高的一類分子，但結核病的發病機制尚不十分清楚，大量的研究證實肺結核與遺傳和環境因素密切相關，是遺傳與環境相互作用的結果［12-14］。因此對HLA 進行分型并分析其與肺結核的相關性已研究甚廣。HLA 分型方法早期主要基于血清學和細胞學的方法，該法分辨率低、成本高。目前已被DNA 為基礎的分型方法取代:順序特異性引物法(Sequence specific oligonucleotide probe，SSP)，該法以少量樣本檢測、低分辨率為主;順序特異性寡核苷酸探針法(Sequence specific oligotide，SSOP)則適合高通量、中分辨率樣本檢測;近些年使用的基于測序的分型方法(Sequence-based typing，SBT)，是目前HLA 分型檢測公認的金標準，具有高通量、高分辨率的特點?；谶@個特點，本研究采用目前分辨率最高的基因型分型方法—SBT 方法分析HLA-DPB1 基因與肺結核的相關性，該分型方法可保證本研究中等位基因分型的可信度和特異性。HLA-Ⅱ類基因與結核的研究多限于HLADRB1 與HLA-DQB1，對于HLA-DPB1 與結核的研究國外研究非常有限，僅限于印度［2，3］，國內暫無其與肺結核的研究，HLA-DPB1 分子與HLA-DRB1 和HLA-DQB1 非常相似，都參與抗原提呈給T 細胞并誘導二次增殖反應。但是HLA-DPB1 與其他疾病的研究國內外較多，例如研究顯示HLA-DPB1* 0501可能為類風濕關節炎的保護基因［15］;HLA-DPB1*0402 可能為陣發性睡眠和I 型糖尿病的保護基因［16-18］;HLA-DPB1* 0201 可能為哮喘的保護性因素［19，20］，HLA-DPB1* 0301 與阿司匹林不耐受哮喘的易感強相關［21］?？煽闯鯤LA-DPB1 在疾病中傾向于明顯的保護作用。本研究對照組中HLA-DPB1* 0201 等位基因頻率明顯高于病例組(OR=0.525，P=0.011)，可以認為HLA-DPB1* 0201 可能是肺結核的保護基因，統計學差異顯著。而HLADPB1* 0501 在病例組的頻率顯著高于對照組(OR=1.578，P=0.038)，則認為HLA-DPB1* 0501 可能為肺結核的易感基因，但由于此P 值接近0.05，不排除因為樣本量小而產生的偏倚和誤差或因HLA-DPB1 等位基因與其他基因座位的連鎖作用，所以HLA-DPB1*0501 為肺結核的易感基因的可信度相對較低，需加大樣本量、進一步分析其單倍型驗證。

近幾十年在不同地域、人群、種族之間進行了很多HLA-Ⅱ類基因與肺結核的研究，但結果不太一致，甚至自相矛盾，可能除了與技術手段有限和樣本量低有關外，還可能與多個基因表達同一種特定肽有關，而這個肽與疾病易感的重要性可能遠遠超過基因本身。因此，需在發現相關易感基因基礎上進一步做功能學驗證。

本研究的結果是初步的，受研究樣本小和HLADPB1 與相關HLA-Ⅱ類基因連鎖的作用的影響，今后還需進一步擴大樣本量，結合家系調查，從HLADPB1 單倍型及與其他基因連鎖不平衡分型等方面進行分析驗證。從基因水平上研究有利于了解肺結核的發病機制，為新型抗結核疫苗的開發、疾病有效防治策略及新疆石河子地區漢族人群肺結核個體化治療提供有益的參考。

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