microRNA-199a/b-3p 對乳腺癌細胞運動能力的影響①

王子航 李春實 康勁松 米旭光 劉 磊 (延邊大學醫(yī)學院，延邊 133002)

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度已高出原高發(fā)國家1～2 個百分點，且呈明顯的年輕化趨勢，每年有16.9 萬婦女患乳腺癌，且發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位［1］。轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導致乳腺癌病人死亡的首要原因，轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生就極少治愈且預后不佳。晚期乳腺癌患者的平均生存時間只有18～30 個月［2，3］。同時，轉(zhuǎn)移常伴隨著對傳統(tǒng)及實驗性治療方法的耐受性［4］。現(xiàn)有的治療靶點和治療藥物對于組織學形態(tài)多種多樣、高度異質(zhì)性的乳腺癌仍顯不足，因此，尋找抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的新治療靶點、新治療手段是研究的重點，將極大改善患者的預后，提高總生存率。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-231 細胞，人胚腎HEK293T 細胞使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中國)的DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素(100 kU/L)、鏈霉素(100 μg/ml)，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要實驗試劑耗材 Transwell 小室(Corning，美國)、基質(zhì)膠(Sigma，美國)、microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中國)、D-luciferin(上海科敏生物科技有限公司，中國)、PVDF 膜(Millipore，德國)、鼠抗PAK4 和HRP 標記羊抗鼠二抗(CST，美國)、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4 干擾載體為本實驗室構(gòu)建、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國)。

1.3 免疫印跡分析 提取細胞總蛋白后，進行常規(guī)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，TBST 配制的脫脂奶粉封閉液封閉24 h，標記鼠抗PAK4 一抗(1∶1 000)室溫1.5 h，TBST 清洗3 次，標記HRP 標記羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST 清洗3 次，ECL 顯影。

1.4 遷移能力和細胞膜皺起動態(tài)分析的檢測 在6 孔板中接種1 ×106個MDA-MB-231 細胞，培養(yǎng)24 h 貼壁后，轉(zhuǎn)染相應質(zhì)粒，24 h 后，記錄12 min 總細胞面積變化，依照文獻方法計算細胞膜皺起動態(tài)變化［5］;劃線，拍照。繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h、48 h 時拍照，Image J 軟件分析遷移能力。

1.5 侵襲能力的檢測 用無血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，饑餓24 h，然后調(diào)整細胞濃度為1 ×105ml-1，將200 μl 細胞懸液接種于Transwell(Transwell小室內(nèi)預鋪Matrigel 膠)小室的上室內(nèi);在24 孔板中加入600 μl 含有20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，然后將Transwell 小室放入24 孔板中;37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h;取出Transwell 小室，用0.01 mol/L 的PBS 輕柔沖洗，然后用棉簽輕柔擦除上室內(nèi)粘附的細胞，在95%的乙醇中固定，最后采用結(jié)晶紫染色;在倒置顯微鏡下，隨機選擇5 個視野(×200)，觀察穿透小室的細胞數(shù)量，取其平均值，每實驗組設(shè)3 個重復，每組實驗均重復3 次。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所得計量資料以±s 表示，組內(nèi)比較采用配對t 檢驗，以P ＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細胞中內(nèi)源PAK4表達 在乳腺癌MDA-MB-231 細胞中，miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染組內(nèi)源PAK4 蛋白表達被顯著抑制(圖1)。

2.2 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細胞遷移侵襲和細胞膜皺起 miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，乳腺癌MDA-MB-231 細胞細胞遷移率分別為0.24 和0.46，與對照0.6 和0.92 相比顯著降低(圖2A)，P ＜0.05;miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染48 h 后，乳腺癌MDA-MB-231 細胞的侵襲率為0.21(圖2B)和平均細胞膜皺起面積為2.4 μm2×103(圖2C)均顯著下降，P ＜0.05。

2.3 干擾PAK4 表達抑制MDA-MB-231 細胞遷移侵襲和細胞膜皺起 在乳腺癌MDA-MB-231 細胞中，轉(zhuǎn)染PAK4 Si 24 h 后，檢測PAK4 蛋白表達，與對照相比PAK4 蛋白表達量顯著降低(圖3A);抑制PAK4 表達24 h、48 h 后的MDA-MB-231 細胞細胞遷移率為0.3和0.7，與對照0.54和0.96(圖3B)相比均顯著下降，P ＜0.05;而抑制PAK4 表達48 h后，MDA-MB-231 細胞侵襲率0.51(圖3C)和平均細胞膜皺起面積2.13 μm2×103(圖3D)均顯著下降，P ＜0.05。

圖1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞內(nèi)源PAK4 蛋白表達Fig.1 Expression of PAK4 inhibited by miR-199a/b-3p

圖2 miR-199a/b-3p 抑制MDA-MB-231 遷移(A)，侵襲(B)和平均細胞膜皺起面積(C)Fig.2 Migration index (A)，invasion index (B)and average protrusive area (C)of MDA-MB-231 inhibited by miR-199a/b-3p

圖3 MDA-MB-231 細胞中PAK4 表達量(A)，干擾PAK4 抑制遷移(B)，侵襲(C)和平均細胞膜皺起面積(D)Fig.3 Expression (A)，migration (B)，invasion (C)and average protrusive area (D)of PAK4 in MDA-MB-231 cellstransfected PAK4i

3 討論

自1991 年至2010 年間，乳腺癌死亡率增長了32.89%，成為死亡率增長最快的癌癥，其發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位［6］。我國城市中乳腺癌死亡率增長了38.91%，已成為對婦女健康威脅最大的疾病［7］。現(xiàn)在乳腺癌的治療藥物以蒽環(huán)類、諾維本、紫杉類和健擇為主導，偏晚期乳腺癌惡性度高，應用化療藥物治療則敏感率低副作用大，且預后差，易復發(fā)和轉(zhuǎn)移［8］。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為20～25 個核苷酸的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的非編碼單鏈的小分子RNA［9］，并且microRNA 可通過胞外體、微囊泡等形式由細胞主動分泌至血液中，被受體細胞所攝取，從而調(diào)控受體細胞的功能，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10，11］。因此，miRNA 在腫瘤診斷、腫瘤分型、預后判斷及基因治療的作用越來越受到關(guān)注。

有研究顯示miR-199a/b-3p 在多種腫瘤細胞中明顯低表達，上調(diào)miR-199a/b-3p 可顯著抑制腫瘤細胞的增殖［12，13］。由前期工作得知，miR-199a/b-3p在乳腺癌組織樣本的表達水平與癌旁正常組織相比顯著下調(diào)。這提示miR-199a/b-3p 可能在乳腺癌的存活發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其是否抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移未見研究。因此，本研究擬探究miR-199a/b-3p對于乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響及相應的分子機制。在乳腺癌MDA-MB-231 細胞中超表達miR-199a/b-3p 后，細胞的遷移侵襲能力明顯下降，說明miR-199a/b-3p具有抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的能力。膜皺起檢測發(fā)現(xiàn)超表達miR-199a/b-3p 后，MDA-MB-231 平均膜皺起面積顯著減少，提示miR-199a/b-3p 可抑制乳腺癌細胞運動能力。并且，miR-199a/b-3p 可以下調(diào)內(nèi)源PAK4 蛋白的表達量，因此我們推測其抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲和膜皺起可能是通過下調(diào)PAK4 實現(xiàn)的。通過干涉內(nèi)源的PAK4 表達，MDA-MB-231 細胞遷移侵襲能力明顯減弱，平均膜皺起面積減少，說明miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細胞運動能力至少部分是通過靶向抑制PAK4 表達實現(xiàn)的。

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