結膜上皮細胞在角膜基質中轉化為角膜上皮樣細胞的研究

程建霞 徐海濤 左 蘭 黃鑫宇 杜園園 (吉林大學第二醫院 眼眶眼整形科，長春 130000)

結膜和角膜上皮細胞來源于不同的細胞系，正常情況下，分化成熟的結膜和角膜上皮細胞表達不同的角蛋白，即角膜上皮細胞表達CK3/CK12 蛋白，而結膜上皮細胞表達CK4/CK13 蛋白。而且，Ck12和Ck13 分別代表終末分化的角膜和結膜上皮細胞，角膜緣干細胞或早期發育角膜細胞不表達CK4和CK13 蛋白［1］。

眼表上皮細胞分化除由其干細胞系所決定外，是否會受到其下基質環境的影響，即成體干細胞是否具有可塑性分化潛能，目前說法不一。如文獻報道，將成年鼠角膜上皮細胞與胚胎鼠生發真皮共培養后，角膜上皮細胞發生轉分化，產生毛囊和皮脂腺樣結構［2］。也有研究者證實，當結膜上皮細胞生長覆蓋在角膜基質表面，雖然可觀察到表現出不同程度的角膜上皮細胞形態學特點，但并不產生Ck12蛋白表達［3］。同樣，當結膜上皮細胞與角膜基質細胞共培養，可以觀察到低水平的Ck3 蛋白表達，但不產生Ck12 蛋白表達［3］。當結膜上皮細胞在人羊膜上培養，同樣沒有發生角膜上皮樣細胞的轉化。有學者從結膜上皮細胞中發現少量Ck12 蛋白陽性表達角膜樣上皮細胞，所以認為決定細胞命運的是原始細胞來源，而不是其基質環境［4］。

針對上述問題，我們通過檢測植入角膜基質中結膜上皮細胞Ck3、Ck12 和Ck4 蛋白表達的改變，研究和檢測角膜基質對結膜上皮細胞基因和蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 包括1∶ 1 DMEM 和Ham F12 混合液，補充體積分數10% 胎牛血清，10 μg/L 人表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，5 mg/L 胰島素，0.5 mg/L 氫化可的松，0.1 nmol/L霍亂毒素，100 ×103U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素。鼠單克隆抗體Muc5AC 購自Abcam Ltd (Cambridge，CB4 0FW，UK);FITC-交聯羊抗鼠IgG 抗體(A lexa-488-labled;Invitrogen，Carlsbad)，CA 鼠單克隆抗體Ck13，Ck4，Ck14，Ck3，Muc5AC;羊單克隆抗體Ck12;FITC-交聯羊抗鼠IgG 抗體與驢抗羊IgG 抗體(Alexa-488-labled);DAPI 封 固 劑(Burlingame，CA)，OCT 膠(OCT，Leica Instrument GmbH，Germany)。

1.2 實驗動物 健康新西蘭大白兔20 只，體重2～2.5 kg，將其分為4 個實驗組，分別為正常對照組、3 d 動物模型、10 d 動物模型及20 d 動物模型，每組各5 只。

1.3 兔結膜上皮細胞分離及培養 選定的上述新西蘭大白兔全身麻醉后，眼局部消毒，摘取雙眼上穹窿部結膜上皮組織(5 ×5 mm2)，用生理鹽水洗滌三次(含100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素)，將其切分成1 ×1 mm2大小組織塊平貼于培養皿中，加入含10%胎牛血清培養液后放入37℃孵育箱中，隔日換液。日常于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁、伸展及細胞生長情況。組織塊培養5～7 d，棄去細胞培養液及結膜組織塊，用0.25%Trypsin 消化后離心并收集，放置在冰盒里以備進行下一步自體角膜基質移植用。

1.4 結膜上皮細胞在角膜基質中轉化的實驗動物模型建立 將實驗兔全身麻醉，用刮匙將顳側半部角膜上皮徹底刮除，用0.9%生理鹽水沖洗該部角膜基質，在距角膜緣2～3 mm 的去上皮的角膜基質層作一長2.0 mm 平行于角膜緣深達一半角膜基質的切口，由該切口向角膜中央方向作一扇形板層隧道，將收集的結膜上皮細胞(6 ×105)放入該角膜基質板層隧道中。術畢托百士眼膏涂眼預防感染。每日用裂隙燈顯微鏡觀察角膜情況。

1.5 實驗樣本采集 實驗兔全身麻醉后。將移植有結膜上皮細胞部分的整片角膜組織取下包埋于OCT 膠中，分別進行H＆E 染色及免疫熒光染色。擬行PCR 檢測的標本則先用刀片徹底刮除角膜上皮細胞、角膜內皮細胞及后彈力膜，用直徑2 mm2的環鉆切取結膜上皮細胞最密集部位的角膜基質，并立即放入-1 500℃冰箱中保存。

1.6 熒光免疫組化分析 將組織樣本切成5 mm厚的超薄組織切片置于載玻片上，室溫下放置半小時，待組織切片稍干后分別進行常規H＆E 染色及免疫熒光染色。

1.7 Real-time PCR 分析 采用Tq-PCR 檢測細胞角蛋白-3、細胞角蛋白-4，波形蛋白基因的表達。應用Trizol 試劑(Invitrogen)從冰凍組織中提取總RNA，cDNA 隨機引物采用cDNA 試劑盒(Invitrogen)按說明書準備，采用PRISM 7700 序列和Taq-Man 基因表達試劑盒(Applied Biosystems)應用適當的稀釋cDNA 逆轉錄PCR。引物從AB 公司訂購。每次實驗均采用無逆轉錄酶的逆轉錄反應作為cDNA 的陰性對照，無cDNA 的PCR 作為PCR 反應的陰性對照，β-肌動蛋白作為內參。

2 結果

2.1 兔結膜上皮細胞組織塊培養形態及蛋白表達培養第24～48 h，組織塊邊緣即有結膜上皮細胞爬出，第5～7 天時，細胞鋪滿培養瓶底，并匯合成單層。這時Ck14 即基底細胞標記蛋白幾乎表達于所有的細胞中，而只有部分細胞Ck4 染色呈陽性，并可見少數細胞Ck3 染色陽性細胞。而Ck3 和Ck12在所有培養細胞中染色均呈陰性。這個結果提示，所培養的該階段細胞為結膜上皮基底細胞。

2.2 植入角膜基質的結膜上皮細胞形態及免疫組化分析 植入術后第2 天角膜上皮高度水腫混濁，第3 天角膜上皮水腫逐漸減退，植入1～2 周時結膜上皮細胞在角膜基質間呈灰白色，清晰可見(圖1)。

圖1 結膜上皮細胞植入角膜基質后兔眼成像Fig.1 Micrograph of rabbit eye after implantation of cultured conjunctival epithelial cells

圖2 結膜上皮細胞植入第1 階段細胞形態及免疫熒光結果Fig.2 Immunohistochemical analysis of implanted conjunctival epithelial cells at Phase I

圖3 結膜上皮細胞植入第2 階段細胞形態及免疫熒光結果Fig.3 Immunohistochemical analysis of implanted conjunctival epithelial cells at Phase Ⅱ

圖4 結膜上皮細胞植入前后不同階段Ck3 和Ck4 基因表達結果，β-肌動蛋白作為內參Fig.4 Quantitative PCR analysis of CK3 and CK4 gene expression in conjunctival epithelial cells before and after implantation at different Phases Note:βactin was used as internal control for the calculation of δCt

第1 階段:結膜上皮細胞在角膜基質內的聚集期H＆E 染色結果顯示被移植的結膜上皮細胞在角膜基質內聚集在一起，呈不規則排列(圖2A)。幾乎所有植入的結膜上皮細胞均有Ck4 陽性表達(圖2B)，少量細胞Ck3 和Ck12 表達陽性(圖2D，2E)，Ck4/Ck12 雙染結果顯示，所有Ck12 表達陽性細胞同時也表達Ck4 蛋白(圖2G)，雖然所培養的結膜上皮細胞無Ck13 表達，但其陽性表達細胞散在分布于所植入的結膜上皮細胞當中，然而Ck12/Ck13雙重染色結果顯示二者無共表達(圖2C)。Ck4 陽性細胞與其周圍的角膜基質之間呈現CollagenIV 陽性染色(圖2F)。Ck12 陽性細胞周圍未見Laminin染色(圖2H)

第2 階段:上皮樣結構形成期 結膜上皮細胞植入后1 周至10 d，H＆E 染色結果顯示植入的結膜上皮細胞排列規則，形成2～3 層細胞層，呈現上皮樣結構(3A)。CollagenIV 和Laminin 連續性表達于植入上皮細胞周圍(圖3H，3I)，提示新的基底膜的產生。幾乎所有移植細胞均呈現Ck4、Ck3 和Ck12 陽性表達(圖3B、3C 和3D);Ck4/Ck12 雙重染色結果示二者呈現共表達現象(圖3E);Ck13 陽性表達較第1 階段減少且Ck13 和Ck12 之間無共表達現象(圖3F，3G)第3 階段:細胞衰退期 植入術后3 周，植入的結膜上皮細胞開始退化、死亡，但是殘存的細胞仍可被Ck3、Ck12、Ck4 染色，CollagenIV 和Laminin 連續性表達于其周圍。

2.3 角蛋白基因表達的定量分析 定量PCR 檢測結果顯示，3 個階段中所有植入細胞CK3 和Ck4 基因表達均呈陽性。將α-actin 作為內部控制，計算植入角膜基質的結膜上皮細胞CK3 和Ck4 基因轉錄并與培養的結膜上皮細胞進行比較(圖4)。在植入第1 階段，與植入前培養的結膜上皮細胞比較，Ck4基因表達降低而Ck3 基因表達則升高;植入第2 階段，角膜基質中的結膜上皮細胞Ck4 基因表達逐漸下降，而Ck3 基因表達略有上升;而植入第3 階段因許多植入細胞開始衰退，Ck3 基因表達不再增加。

3 討論

關于上皮細胞分化有兩方面問題值得我們關注，即是否上皮細胞的分化是從胚胎期或初生期開始，并呈程序性及不可逆性發展，以及是否這些上皮細胞生長和分化受它們各自的基質所影響。我們將培養的成體兔眼結膜上皮細胞移植入自體角膜板層基質中，結膜上皮細胞分化會一步一步地發生轉變，而且這種轉變同時伴隨著基因表達的改變。

首先，我們證實了結膜上皮細胞可在植入兔角膜基質中形成上皮樣結構并存活3 周，植入的結膜上皮細胞可呈現Ck3 和Ck12 陽性表達且隨著植入時間延長其陽性表達細胞數量逐漸增加。同時因植入的細胞Ck4 蛋白仍呈陽性表達，說明這些細胞依舊保留結膜上皮細胞特點。因此我們證明植入角膜基質的結膜上皮細胞呈現角、結膜上皮細胞共同特點。

另外，植入角膜基質中結膜上皮細胞Ck3 蛋白表達增加。據文獻報道［5］，通過Western blot 凝膠電泳顯示兔結膜上皮細胞Ck3 可呈低水平表達，當結膜上皮細胞培養在羊膜上時這種Ck3 表達則明顯增加［3］。我們實驗結果與之次相符，即在培養的兔結膜上皮細胞中可檢測到少量Ck3 表達細胞，進而大多數植入角膜基質中7 天后的結膜上皮細胞其Ck3 呈陽性表達。我們沒有觀察到植入細胞的增殖，所以不支持Ck3 陽性表達細胞增加為初始Ck3陽性細胞分裂增殖而來。另外，PCR 檢測結果顯示植入角膜基質的結膜上皮細胞Ck3 基因表達較培養的結膜上皮細胞增加，該結果支持植入結膜上皮細胞在角膜基質環境作用下Ck3 表達增加。通過以往文獻報道，培養的結膜上皮細胞可檢測Ck3 陽性細胞，而Ck12 則檢測不到［3，5］。

Kurpakus［6］研究發現，當將牛結膜上皮細胞培養在角膜基底膜上，可出現Ck12 陽性細胞表達。同樣，在培養的兔結膜上皮細胞熒光免疫組化染色Ck12 表達完全呈陰性，而絕大多數植入的結膜上皮細胞Ck12 蛋白表達呈陽性，因Ck12 為終末分化的角膜上皮細胞標記物，我們研究證實角膜基質環境可以誘導結膜上皮細胞轉化為角膜樣上皮細胞。同樣與Ck3 和Ck12 表達相似，當結膜上皮細胞植入角膜基質后其Ck4 表達明顯下降，但仍持續存在與植入上皮細胞中。在植入第2 階段，出現CK3/CK12/CK4 蛋白共表達現象，提示植入細胞呈現角、結膜上皮細胞共有特性。

通過實驗進一步證實角膜基質通過作用于低分化的結膜上皮細胞使其發生轉化。因為培養的結膜上皮細胞通過免疫組化分析證實其Ck14 蛋白表達陽性而Ck13 蛋白表達陰性，符合基底細胞蛋白表達特點［7］。這種培養的結膜上皮細胞角蛋白表達特點可能是因為我們所用培養液更有利于細胞增殖而不是分化。其次，我們沒有發現植入的上皮細胞共表達Ck12 和Ck13，提示二者之間不存在共有蛋白表達現象。然而，因我們實驗中Ck13 蛋白表達量很少，所以我們可能還需要更多實驗進一步證實此觀點。此外，由于抗體產品的限制，我們無法檢測Ck13 和Ck3 共表達情況，以證實是否成熟的結膜上皮細胞能夠在角膜基質誘導下發生轉化。

關于上皮細胞在特殊基質環境中轉分化及相關機制，以往文獻也有報道［8］。如將成人角膜上皮細胞植入到胚胎真皮層中，角膜上皮細胞發生轉化并形成上皮和毛囊組織［2］。也有研究者觀察到角膜緣干細胞損傷后，覆蓋于角膜基質的結膜上皮細胞呈現角膜上皮特點［9］。但也有人反對此觀點，認為這些具有角膜樣上皮特點的細胞仍來源于殘存的角膜緣干細胞［10］。所以，對于角膜基質表面的結膜上皮細胞轉化為角膜樣上皮細胞目前還沒有更理想的角膜重建證據［11］。實際上，這些有關結膜上皮細胞在角膜基質表面生長、分化及轉化的動物模型設計很容易受其他因素影響，如新生血管、淚膜和血液攜帶的炎癥因子及暴露的空氣，可能會干擾結膜上皮細胞向角膜上皮細胞方向轉化的能力。所以我們實驗設計排除了這些干擾因素，單純研究角膜基質單一誘導環境對于結膜上皮細胞轉化作用。

以往研究證實，氣液交界面是促進結膜上皮細胞分層和分化的關鍵因素［12］。研究中發現，雖然在植入第2 和第3 階段結膜上皮細胞周圍可以觀察到基底膜形成，但植入的結膜上皮細胞在角膜基質中很少增殖和分層。另外，雖然Ck13 在培養的結膜上皮細胞中無表達，但在植入的角膜基質細胞中可減少量表達，考慮因缺乏空氣限制了植入上皮細胞的分化和分層。但這種獨立的誘導環境同時也排除了細胞轉化的干擾因素。

總之，我們的研究結果顯示，結膜上皮細胞可以在角膜基質環境誘導下發生橫向轉化，表達角膜上皮樣細胞特點。我們該實驗的成功為成體干細胞可塑性研究提供了又一有力證據，顯示了用結膜干細胞代替角膜緣干細胞應用于臨床的潛在前景，為組織工程化角膜上皮構建提供了更充沛的種子來源。

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