黃芩苷對熱應激條件下LLC-PK1細胞HSP70 表達的影響

遲世凱，孫春玲，李華濤，叢 霞，姜忠玲，王 新，曹榮峰，田文儒

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

中獸醫認為，高溫作為應激因子對機體產生熱應激乃至造成熱應激綜合征，最后往往以腎功能衰竭而死亡[1]。黃芩苷（Baicalin）是從黃芩的干燥根中提取出的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，其解熱作用顯著[2]，Tsai 等[3]研究認為黃芩苷可能通過抑制下丘腦中N-甲基-D-天冬氨酸受體依賴羥基旁路和TNF-α的增加從而發揮其解熱作用。目前關于黃芩苷單體解熱方面的研究甚少，其解熱機制的研究也尚未深入，以黃芩為主藥的中藥復方解熱機制方面的研究也不多，且復方研究結果不能代表單味藥。現已證明，多種體外培養的細胞和胚胎受熱后均能產生熱休克蛋白（HSP），HSP70 是HSPs 家族里含量最多，亦是最重要的一種非特異性細胞保護蛋白，尤其對體外培養的細胞具有顯著的抗熱保護作用[4-5]。劉萍等[6]研究表明，黃芩苷能夠促進大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬神經元HSP70 的表達，而黃芩苷能否調節熱應激條件下的細胞合成HSP70，目前未發現有任何報道。因此，本研究擬探討不同濃度黃芩苷對熱應激條件下豬腎小管上皮（LLC-PK1）細胞HSP70 表達的影響，以期為黃芩苷的解熱作用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 黃芩苷，購自北納創聯生物技術研究院；高糖DMEM和胰蛋白酶，購自GIBCO公司；胎牛血清，購自HyClone 公司；RNA提取試劑盒，購自原平皓生物有限公司；反轉錄試劑盒、rTaqDNA聚合酶和DL-1 000 Marker，購自TaKaRa公司；LightCycler?480 SYBR Green I Master，購自Roche 公司；HSP70、GAPDH 抗體和兔抗羊IgGHRP 分別，購自Santa Cruze 公司和Jackson ImmunoResearch 公司；BLUeye Prestained Protein Ladder，購自GeneDireX 公司；Western 及IP 細胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL 熒光底物試劑盒，購自碧云天生物制品有限公司。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank 中收錄號為NM001123127的豬HSP70 基因序列和XM003357928豬β-Actin基因序列設計引物，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。序列如下：HSP70 Sense primer：5′-GCCCTGAATCCGCAGAATA-3′，Anti-sense primer：5′-TCCCCACGGTAGGAAACG-3′，擴增片段長度為152 bp；β-Actin：Sense primer：5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′，Anti-sense primer：5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′，擴增片段長度為411 bp。

1.3 細胞培養與試驗分組 LLC-PK1 細胞為美國ATCC細胞庫第3 代細胞，購自上海復祥生物科技有限公司。細胞用含12%胎牛血清的高糖DMEM在37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養，待細胞覆蓋率達到80%～90%后傳代，傳代細胞用于后續試驗。

試驗分為Ⅰ組37 ℃常溫對照組，Ⅱ組42 ℃單純熱應激1 h 組，而Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組和Ⅶ組分別添加0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 不同濃度黃芩苷培養24 h 后再將其42 ℃熱應激1 h 組。

1.4 cDNA合成與PCR 擴增電泳 按照RNA快速提取試劑盒（原平皓生物有限公司）說明書，提取各組細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒（TaKaRa 公司）說明書，進行RT 反應。將合成的cDNA進行PCR 擴增，產物經2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/L 溴化乙錠）電泳，由GDS-8000 凝膠成像分析系統拍照鑒定。

1.5 熒光定量PCR 檢測HSP70 基因的表達 將合成的cDNA產物做一系列濃度梯度稀釋，使用Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR 儀進行定量分析。反應體系為10 μL，其中包括：ddH2O23.6 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA1 μL。反應條件為95 ℃10 min，95 ℃5 s 和58 ℃30 s，共45 個循環。

1.6 Western Blot 檢測HSP70 蛋白的表達 提取細胞總蛋白，混合2×SDS樣品緩沖液加熱變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，4℃條件下220 mA恒流濕轉2 h，再封閉2 h，按順序加入一抗二抗孵育后，用ECL 試劑盒進行化學發光，最后用UVP 凝膠成像系統拍照檢測，用AlphaView對試驗結果進行灰度值分析。

1.7 數據統計分析 采用SPSS16.0 軟件做統計學處理，各組數據進行LSD多重比較，均數間進行t檢驗。

2 結果

2.1 PCR 擴增 利用設計的HSP70 和β-Actin 引物進行PCR 擴增，在152 bp 處擴增到了一條HSP70 的條帶，在411 bp 處擴增到了一條β-Actin的條帶，與預期值相符合，經基因測序證實其為目的基因產物。

2.2 HSP70 mRNAReal-time PCR 結果 各組細胞以β-Actin 做內參基因，用2-△△Ct法進行相對定量分析后發現（圖1），與37 ℃常溫對照組相比，其他各組LLC-PK1 細胞HSP70 mRNA的表達量均升高，其中Ⅵ組和Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），其余各組差異顯著（P＜0.05）；與42 ℃單純熱應激組相比，除Ⅰ組外，其余各組LLC-PK1 細胞HSP70 mRNA的表達量均升高，其中Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ租和Ⅶ組差異顯著（P＜0.05）。

圖1 各組LLC-PK1細胞HSP70 m RNA相對表達量

圖2 HSP70和GAPDH蛋白電泳

圖3 各組LLC-PK1細胞HSP70 蛋白相對表達量

2.3 HSP70 蛋白Western Blot 結果 Western Blot檢測蛋白表達的結果（圖2）用AlphaView軟件掃描其灰度，并對數據進行統計分析發現（圖3），與37 ℃常溫對照組相比，其他各組LLC-PK1 細胞HSP70 蛋白的表達量均升高，其中Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），其余各組差異顯著（P＜0.05）；與42℃單純熱應激組相比，除Ⅰ組外，其余各組LLCPK1 細胞HSP70 蛋白的表達量均升高，但Ⅲ組和Ⅶ組差異不顯著，Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），Ⅳ組和Ⅵ組差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

細胞在受到高溫、缺氧及重金屬等應激源刺激時，細胞過表達HSP70，而HSP70 能夠增加細胞自身對損害的耐受力，維持細胞正常功能代謝，提高其存活率[7]。因此，很多研究者嘗試過許多方法來增加細胞中HSP70 的表達[8-9]，從而提高細胞抗應激的能力，但在培養液添加中草藥的單一成分來提高細胞的HSP70 表達的報道甚少，添加黃芩苷的尚無報道。

據報道黃芩苷具有清熱解毒、抗菌消炎、抗氧化、降壓，及鎮靜等作用[10]。而李倩楠[11]曾經報道，高劑量黃芩苷（160 mg/kg）灌服能明顯降低發熱大鼠的體溫，并認為黃芩苷可能通過抑制TNFA和IL-1B的產生或釋放，繼而引起IL-6 的改變，再使PGE2 合成減少,從而發揮解熱作用。趙紅艷[12]等研究表明，黃芩苷可以通過降低下丘腦中PGE2 和cAMP 的含量來起到解熱作用。

本試驗42 ℃單純熱應激1 h 能顯著誘導LLC-PK1 細胞HSP70 的表達，說明42 ℃的溫度能夠引起細胞的熱休克反應。與37 ℃常溫對照組相比，在LLC-PK1 細胞培養液中添加的黃芩苷在1 μg/mL 以 下（0.01～1 μg/mL）時，細胞表達HSP70 的量隨黃芩苷濃度增加而升高，而當黃芩苷濃度在1 μg/mL 以上（1～100 μg/mL）時，雖然細胞HSP70 表達呈降低趨勢，但仍顯著高于對照組，這說明黃芩苷（0.01～100 μg/mL）能夠上調熱應激條件下LLC-PK1 細胞HSP70 的表達。與42 ℃單純熱應激組相比，黃芩苷（0.01～100 μg/mL)均能顯著增加細胞HSP70 mRNA的表達，但0.01 μg/mL 和100 μg/mL 黃芩苷對細胞HSP70 的蛋白表達無顯著性影響，首先，有研究表明[13]，真核基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔，轉錄和翻譯還受到多種因素調控，因此mRNA的表達水平并不一定代表蛋白的表達水平；其次，極有可能因為0.01 μg/mL 的黃芩苷濃度太小，不足以誘導熱應激條件下細胞HSP70 蛋白的表達，而100 μg/mL 的黃芩苷的濃度又過大，抑制了熱應激條件下細胞HSP70 蛋白的持續高表達，所以，試驗成功篩選出黃芩苷誘導熱應激條件下LLCPK1 細胞HSP70 表達的最佳濃度范圍，即0.1～10 μg/mL，且1 μg/mL 的黃芩苷誘導效果最顯著。

[1]劉鐘杰，許劍琴.中獸醫學[M].北京：中國農業出版社，2002：453-455.

[2]梁英，韓魯佳.黃芩中黃酮類化合物藥理學作用研究進展[J].中國農業大學學報，2003，8（6）：9.

[3]Tsai CC，Lin MT，Wang JJ，et al.The antipyretic effects of baicalin in lipopolysaccharide-evoked fever in rabbits[J].Neuropharmacology，2006，51（4）：709-717.

[4]Aréchiga CF，Ealy AD，Hansen P J.Evidence that glutathione is involved in thermotolerance of preimplantation murine embryos[J].Biology of Reproduction，1995，52：1296-1301.

[5]Gifondorwa DJ，Robinson MB，Hayes CD，et al.Exogenous delivery of heat shock protein 70 increases lifespan in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J].The Journal of Neuroscience，2007，27（48）：13173-13180.

[6]劉萍，菊英，李倩，等.黃芩苷對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬神經元HSP70 表達的影響[J].藥學學報，2006，41（7）：619-624.

[7]Radons I，Multhoff G .Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70[J].Exerc Immu-nolRev，2005，11：17-33.

[8]Roesslein M1，Schibilsky D，Muller L，et al.Thiopental protects human T lymphocytes from apoptosis in vitro via the expression of heat shock protein 70[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2008，325（1）：217-225.

[9]Chu E K，Ribeiro SP，Slutsky AS.Heat stress increases survival rates in lipopolysaccharide-stimulated rats[J].Critical Care Medicine，1997，25：1727-1732.

[10]孫先枝，程建波，卜登攀，等.黃芩苷的生物學功能和黃芩及其提取物在畜禽生產中的應用研究進展[J].動物營養學報，2013，25（7）：1459-1464.

[11]李倩楠，葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對細胞因子的影響[J].中國中藥雜志，2010，35（4）：1068-1072.

[12]趙紅艷.黃芩苷對發熱大鼠下丘腦PGE2 和cAMP 含量的影響[J].中國應用生理學雜志，2002，18（2）：139-141.

[13]de Sousa Abreu R，Penalva L O，Marcotte E M，et al.Global signatures of protein and mRNAexpression levels[J].Molecular Bio-Systems，2009，5（12）：1512-1526.