調節性T細胞與人乳頭瘤病毒感染宮頸癌的相關性研究進展

辛丹丹，佐滿珍，劉朝奇

（1.三峽大學人民醫院婦產科，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學分子生物學研究所，湖北 宜昌 443002）

調節性T細胞與人乳頭瘤病毒感染宮頸癌的相關性研究進展

辛丹丹1，佐滿珍1，劉朝奇2

（1.三峽大學人民醫院婦產科，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學分子生物學研究所，湖北 宜昌 443002）

人乳頭瘤病毒(HPV)的持續感染已被證實是宮頸癌發生的必要因素。HPV病毒在感染機體的過程中，不僅可以誘導機體產生特異性的免疫應答，同時也可以逃避機體的免疫應答，從而使機體產生免疫耐受，最終導致宮頸癌的發生。有研究顯示調節性T細胞(Treg)參與了病毒引起的免疫應答，它可以維持機體對病毒的免疫耐受，最終引起病毒持續感染。既往關于Treg細胞與宮頸癌發生的關系主要集中在外周血中Treg細胞相關的細胞因子，很少關注Treg細胞與HPV的關系，本文將對Treg細胞與HPV存在狀態的關系以及在HPV感染引起宮頸癌過程中的作用進行綜述。

人乳頭瘤病毒；宮頸癌；調節性T細胞；免疫耐受

HPV病毒是一種嗜上皮性的雙鏈閉合DNA病毒，主要通過性傳播，其中70%～90%的HPV感染的個體能夠在1～2年內靠自身免疫自行清除病毒，僅少數感染者體內存在HPV持續感染，進而引起惡性腫瘤階梯式發生。大量的研究表明，宮頸癌不是由HPV單獨直接引起，而是HPV感染后引發的機體與病毒之間免疫反應的共同結果。決定HPV感染持續時間以及是否發展為高級別病變取決于人體局部和全身免疫監視系統的變化，免疫逃逸在這個過程中具有重要作用。腫瘤的發生可通過多種途徑逃避免疫系統的清除，包括CD8+T細胞、NK細胞的功能喪失以及Treg細胞發揮的免疫抑制功能等。同時近年來研究也證實，Treg細胞在多種人類腫瘤中參與了免疫抑制反應，與腫瘤的免疫逃逸有密切關聯。在HPV16 (+)的宮頸癌患者體外消除CD25+T細胞可增加抗HPV16 E6/E7肽的IFN-γT細胞應答，提示患者體內存在抗HPV的反應，并且發現人體外周血中Treg細胞增多與HPV的持續感染有關。

1 Treg細胞

CD4+T細胞根據其分泌細胞因子可分為Th1、Th2、Th17和Treg細胞。初始CD4+T細胞在不同的細胞因子作用下可以分化為不同的細胞亞群，當在TGF-β和IL-6共同作用下則分化為輔助性T細胞17 (Th17)，而僅在TGF-β作用下分化則為Treg細胞。根據來源不同，Treg細胞可分為天然Treg細胞(nTreg)和誘導性Treg細胞(iTreg)，前者主要是CD4+CD25+Treg細胞，由胸腺細胞分化而來。后者主要包括輔助性T細胞3(Th3)、調節性T細胞1(Tr1)，主要是由外周成熟的CD4+CD25-T細胞受抗原刺激并在某些特定細胞因子的誘導下轉化而成。大量研究證實，nTreg以靶細胞相互接觸的方式發揮抑制靶細胞功能的作用，而iTreg主要以細胞因子依賴的方式起作用。CD4+CD25+Treg細胞通過活化T細胞的CTLA-4，抑制活化T細胞的免疫功能；Tr1分泌IL-10抑制T細胞的增殖分化；Tr3分泌TGF-β抑制效應細胞增殖和分化，同時抑制細胞因子的產生以降低其免疫功能。Treg細胞這種免疫抑制和免疫無能的特性，在維持機體自身免疫耐受中具有重要作用[1]。

CD25即白細胞介素IL-2受體A鏈，CD4+CD25+Treg細胞首次被報道是1995年Sakaguchi等從小鼠CD4+T細胞中分離出高表達CD25的T細胞亞群，然后將其輸到裸鼠體內，發現可以預防裸鼠因缺乏這類細胞而引起的自身免疫性疾病。因此，CD25之前一直也被用作Treg細胞的鑒別，普遍也認為CD4+CD25+Treg是免疫抑制的Treg細胞[2]。

Foxp3是叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄調節因子家族一員，Treg細胞的產生依賴于Foxp3的表達，它是維持Treg細胞免疫抑制的必要因素，可以促使CD4+CD25-T細胞轉化為CD4+CD25+T細胞，一直被認為是調控Treg細胞特異性的標志性轉錄因子。它對Treg細胞免疫功能的調節可能是通過影響其發育而發揮作用的，如CD4+T細胞介導免疫抑制是通過抑制IL-2的產生和效應T細胞的增生，而這個過程依賴于Treg細胞中Foxp3的表達，同時，如果沉默Foxp3基因，會導致機體發生自身免疫性疾病[3]。

2 Treg/Th17細胞比例失衡與疾病的關系

輔助性T細胞17(Th17)因產生大量的IL-17而命名，主要在感染的組織募集中性粒細胞，促進炎癥反應，而Treg細胞則主要是抑制炎癥反應。因此，當抑炎性的Treg細胞與促炎性的Th17細胞之間的平衡被打破，就會導致炎癥、自身免疫性疾病以及腫瘤的發生。

Wang等[4]通過檢測中重度慢阻肺(COPD)患者與健康人外周血中Th17與Treg細胞相關細胞因子濃度，以及其各自表面標志物的表達水平，發現Th17與Treg細胞比例失衡可進一步降低中重度COPD患者的肺功能。Sereshki等[5]發現Th17/Treg比例失衡是引起反復自然流產的因素之一。Zhang等[6]研究兒茶酸對心肌的保護作用機制，證實兒茶酸可以明顯抑制免疫激活，調節IL-17/IL-10的水平和外周血、脾臟中Th17/Treg細胞的比例，從而顯著提高CHF小鼠的心肌功能。

類風濕性關節炎(RA)是一種多系統參與的自身免疫性疾病，近年來研究證實Th17細胞及其分泌的Th17與RA發生密切相關。STAT-3是Th17細胞分化過程中主要的轉錄因子[7]，并且能在發炎的滑膜中被活化，這在RA的動物模型中也被證實。當用STAT-3的抑制劑STA-21處理用IL-1拮抗劑沉默IL-1受體的小鼠，發現Th17細胞比例下降，而Foxp3+Treg細胞比例升高[8]。此外Moon等[9]用瑞巴匹特處理膠原誘導性關節炎模型小鼠，可以明顯降低小鼠的臨床關節炎評分、組織的炎癥以及關節軟骨的破壞程度，而其主要作用機制與恢復Th17/Treg細胞比例的平衡有關。

3 Treg細胞與HPV感染的關系

有研究通過比較HPV持續感染患者(包括發展為CINⅢ級和未發展為CINⅢ級)和HPV(-)患者體內Treg細胞比例，發現HPV持續感染患者Treg細胞比例較HPV(-)患者明顯增高，而在HPV持續感染下，CINⅢ級患者與未發展為CINⅢ級患者之間差異無統計學意義。同時有研究發現宮頸CINⅢ女性外周血中針對HPV抗原的免疫反應明顯較有HPV感染但宮頸正常者減弱。Treg細胞在人類多種惡性腫瘤抑制抗腫瘤免疫，而且從宮頸癌患者轉移的淋巴結和腫瘤組織中分離出HPV特異性Treg細胞在體外能夠抑制同型活化的CD4+效應細胞。當在體外消耗CD25+T細胞能夠增強HPV16 E6和E7特異性Th細胞的反應，暗示人體內存在著內源性抗HPV反應，而這種反應受Treg細胞的調節[10]。

4 miRNA對Treg細胞生物學功能的調節

microRNA(miRNA)是一種存在于細胞內的小分子非編碼調控的單鏈RNA，由18～25個核苷酸組成，成熟miRNA進入miRNA誘導的基因沉默復合物，與靶mRNA結合，通過誘導靶mRNA的切割降解、抑制翻譯或其他形式的調節機制抑制靶基因的表達，參與人類各種疾病的發生和發展[11]。

越來越多的研究證實miRNA對Treg細胞的增殖能力、生理功能的調節有重要作用。Chatila等[12]發現miR-199a-5p在COPD患者Treg細胞中的表達幾乎是正常吸煙者的1/4左右，而且很多已被證實是miR-199a-5p靶基因都與TGF-β信號通路相關。Li W研究發現miR-568通過抑制高滲透誘導因子(NFAT5)的表達，抑制CD4+T細胞和Treg細胞的活化和功能[13]。尋常型牛皮鮮(PV)是一種T細胞介導的自身免疫性皮膚病，Zhao等[14]檢測PV患者與正常人CD4+T細胞中miR-210表達水平，發現前者表達高于后者，并且證實Foxp3是miR-210的靶基因之一，miR-210通過抑制Foxp3的表達，從而破壞Treg細胞的免疫抑制功能，引起PV的發生。MiR-155可以調控參與Foxp3表達、IL-4信號、免疫球蛋白IgE類型轉換以及Fc RI表達的關鍵性靶基因，并且對免疫系統的發育具有重要意義，當消除miR-155會導致IL-2/STAT5信號受限，并且Treg細胞數量也明顯減少，這是由于miR-155通過沉默IL-2R/STAT5信號負調節因子：細胞因子信號轉導抑制因子1(SOCS1)，從而促進Foxp3的表達[15]。MiR-146以STAT1為靶點調節Treg細胞介導的免疫功能，并且能保持Treg細胞的特性，當消除Treg細胞中miR-146，引起嚴重的自身免疫性表型類似于miRNA形成過程中重要的剪切酶Dicer基因敲除的動物表型，表現為外周血中出現大量功能不良Foxp3+T細胞[16-17]。

5 HPV E6/E7通過調控microRNA的表達促進宮頸癌發生

高危HPV感染是宮頸癌發生的必要因素。HPV能夠編碼6個具有調節功能的早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)和2個參與蛋白衣殼形成的晚期蛋白(L1和L2)。其中，E6、E7是主要癌蛋白，它們分別使細胞抑癌基因p53和pRB失活而導致宮頸癌的發生。E6通過泛素化蛋白水解途徑導致p53的降解，干擾細胞凋亡；E7通過結合pRB蛋白使E2F從pRB-E2F復合物中釋放，而且釋放的E2F可以激活S期細胞周期蛋白cyclinA、cyclinE、CDK2基因轉錄促進細胞增殖，E2F還可以誘導c-Myc的表達[18]，E7也可以直接激活c-Myc轉錄。

然而，HPV確切致癌機制尚未完全明了，miRNA的發現無疑為此提供新的視角。研究發現，miRNA不僅能在轉錄后水平調節基因表達，其自身同樣在轉錄及轉錄后水平被調節，多數miRNA表達受p53、E2F及c-Myc的調控[19]。p53作為轉錄因子通過結合啟動子區p53結合位點直接激活一些miRNA的基因轉錄(如miR-23a、miR-26a和miR-34a)，另外，p53還可以間接地通過對E2F1的抑制來下調一些miRNA的表達(如miR-106a、miR-106b、miR-17-5p等)，而有報道稱p53激活B細胞易位基因3(BTG3)表達，而BTG3直接與E2F1結合并抑制E2F1的活性。多數miRNA基因的啟動子區含有E2F結合位點，與E2F結合可激活miR-17-92、let-7i、miR-15b/16-2的表達。c-Myc是miRNA表達有力的轉錄調節因子，可上調miR-17-92家族及E2F1表達；c-Myc的過表達也能廣泛地抑制miRNAs(如let-7a-1/f-1d、miR-15a、miR-29、miR-34等)的表達，染色質免疫沉淀顯示這種抑制大多數是c-Myc直接作用于這些miRNAs基因啟動子的結果[20]。由此可見，HPV癌蛋白可通過調控miRNA的表達促進宮頸癌的發生

6 Treg細胞在宮頸癌發生的生物學作用

Treg細胞廣泛的免疫抑制作用機制是通過一系列的抑制機體免疫功能而發生的，主要包括：分泌抑制性細胞因子(TGF-β、IL-10等)；依賴顆粒蛋白酶、穿孔素溶解靶細胞；降低抗原呈遞細胞活化T細胞的能力[21]。

高危HPV編碼三種蛋白：E5、E6、E7(其中后兩者宮頸高級別病變及宮頸癌中持續表達)參與了宮頸癌變早期的免疫逃逸。尤其是E5蛋白通過下調MHC/HLA I類分子，促進病毒誘導的免疫逃逸及降低對CD8+T細胞的識別能力，最重要的是這種下調不會影響細胞表面逃避自然殺傷反應的HLA-C/E，而是選擇性抑制HLA-A和HLA-B的表達，高危HPV就是以這樣的方式逃避CTL和NK細胞的殺傷，從而得以持續感染。而在晚期，由于病毒基因整合到宿主基因組，導致細胞永生化和突變，E2和E5缺失，而E6和E7仍然發揮著重要的作用，比如，E6可以降低上皮細胞表達鈣粘連蛋白1(CDH1)，E6/E7抑制活化抗原呈遞細胞所必需的TLR-9的轉錄，E7可以下調抗原處理相關轉運子1(TAP1)進而抑制特異性T淋巴細胞的活化。此外，高危HPV還能夠下調促炎因子的表達[22]。

HPV感染引起宮頸癌的發生與幾個因素相關，包括高危HPV的型別、HPV的持續感染、高危病毒載量、病毒DNA的整合以及病毒癌蛋白E6和E7的活性。近年來研究顯示Treg參與HPV陽性的宮頸瘤變進展，Treg細胞在宮頸癌發生過程中的作用大概包括：一方面通過分泌TGF-β、IL-10等抑制性的細胞因子，另一方面通過抑制腫瘤生長微環境中的抗原呈遞細胞(如樹突細胞)，參與并促進宮頸癌的免疫逃逸。在HPV持續感染的患者體內，其Treg細胞顯著增高，可能是HPV病毒感染誘導了Treg細胞的產生，再通過分泌抑制性細胞因子或細胞間直接接觸的方式發揮免疫抑制作用，最終導致病毒的持續感染和宮頸癌的發生。有研究表明宮頸癌患者體內Treg細胞生物活性增加，這可能是引起機體針對抗原的免疫應答減弱以及導致機體機體免疫功能障礙的主要原因。

7 總結

多種病毒感染可誘發Treg細胞的產生，從而通過分泌抑制性的細胞因子、細胞之間直接接觸的方式抑制免疫應答，最終引發病毒的持續感染和導致腫瘤的發生。HPV相關的腫瘤MHC-I類分子表達下調，抗原處理能力減弱，病毒逃避T細胞介導的殺傷，Treg細胞滲出以及其分泌的具有免疫抑制功能的細胞因子引起的免疫抑制增強，這些都是免疫治療HPV相關的宮頸癌的主要障礙。盡管我們知道CD4+CD25+Treg與宮頸癌發生密切相關，但是一方面考慮到除去人體內的CD4+CD25+Treg較困難，另一方面如果除去Treg細胞，在誘發腫瘤免疫的同時，可能又會引起自身免疫病發生的可能。

既然研究證實HPV癌蛋白E6、E7能夠通過調控miRNA的表達促進宮頸細胞發生永生化，而miRNA又能調控Treg細胞參與免疫抑制功能。因此，我們猜測在宮頸癌發生過程中，HPV、miRNA、Treg細胞三者之間必然存在著相互聯系，這為今后研究HPV引起宮頸癌發生的機制提供了新的視角。同時，我們也需要進一步研究Treg細胞的生物學特征及其功能，以Treg細胞為靶點，為HPV持續感染或發生癌前病變的女性患者提供治療性干預，為宮頸癌預防及免疫治療提供更有價值的臨床研究基礎。

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Correlation between regulatory T cell and HPV infectedcervical cancer.

XIN Dan-dan1,ZUO Man-zhen1,LIU Chao-qi2.1.Department of Obstetrics and Gynecology,People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA;2.Institute of Molecular and Biology,Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

Persistent infection of human papilloma virus(HPV)has been proved to be a necessary cause of cervical cancer.During the infection process,HPV can not only induce specific immune response but also evade immune clean,which result in immune tolerance and eventually lead to the occurrence of cervical cancer.Increasing researches have shown that regulatory T cells(Treg)was involved in the immune response caused by virus.The Treg cells helped maintain the body's immune tolerance,which can eventually lead to persistent infection of the virus.Previous researches about the correlation between Treg cells and cervical cancer focused mostly on the cytokines in peripheral blood,while little attention was paid to the correlation between Treg cell and HPV.Therefore,interaction between Treg cell and HPV in different infection stages and the role of Treg cell in cervical cancer are reviewed in this paper.

Human papilloma virus;Cervical cancer;Regulatory T cells;Immune tolerance

R737.33

A

1003—6350（2015）10—1480—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0527

2014-10-18)

三峽大學2014年碩士學位論文培優基金資助（編號：2014PY051）

佐滿珍。E-mail：ycyy_zmz@126.com