慢速程序化冷凍人類擴張期囊胚的效果觀察

柳朝華，高士友，鄧朝暉，李 昀

（湖南省婦幼保健院生殖中心，湖南 長沙 410008）

慢速程序化冷凍人類擴張期囊胚的效果觀察

柳朝華，高士友，鄧朝暉，李 昀

（湖南省婦幼保健院生殖中心，湖南 長沙 410008）

目的 探討慢速程序化冷凍在人類擴張期囊胚冷凍中的應用效果。方法收集2014年1～4月在本中心進行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)治療的579個周期患者移植及冷凍后剩余的低質量胚胎(包括異常受精胚胎)發育成的擴張期囊胚87枚，用顯微注射針刺穿囊胚腔使之皺縮，然后行程序化冷凍(囊胚組)。對照組為同期行程序化凍融的卵裂期胚胎。比較兩組經冷凍復蘇后的胚胎存活率。結果擴張期囊胚復蘇率為80.46%，卵裂期胚胎復蘇率為82.80%，兩組比較差異無統計學意義(χ2=1.105，P＞0.05)。結論擴張期囊胚經人工皺縮后行程序化冷凍行之有效，能明顯提高囊胚的冷凍效率。

擴張期囊胚；人工皺縮；慢速程序化冷凍

隨著囊胚移植的發展，囊胚的冷凍保存顯得日益重要，改進和完善囊胚的冷凍保存方法成為當前輔助生殖領域研究的熱點之一。普通的程序化冷凍人類囊胚雖已獲得妊娠及足月分娩，但易出現冷凍損傷，使得復蘇率和妊娠率不穩定[1]。較多研究表明人工皺縮囊胚腔能有效提高囊胚玻璃化冷凍的效果[2-3]。而隨著玻璃化冷凍技術的飛速發展，國內外一部分生殖中心已經放棄了慢速程序化冷凍。人類胚胎冷凍真的已經到了玻璃化冷凍的時代了嗎？

本研究應用慢速程序化冷凍法凍融人工皺縮后擴張期囊胚及卵裂期胚胎，分別比較兩組胚胎復蘇后的存活情況，觀察慢速冷凍對擴張期囊胚的凍存效果，為臨床應用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1～4月在本生殖中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)治療的579個周期資料。患者年齡22～43歲，平均(31.9±4.2)歲。不孕原因包括輸卵管因素、多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、男方因素及不明原因不孕等。夫妻雙方染色體結果均正常。

1.2 方法 采用本中心常規方法促排卵、取卵，體外受精及培養，根據患者及胚胎情況決定移植時間，剩余的符合冷凍標準的胚胎進行程序化冷凍。對于移植或冷凍后剩余的非優質胚胎(胚胎碎片較多或者發育速度緩慢)及異常受精胚胎，經患者知情同意后進行囊胚培養。如果有囊胚形成，將符合冷凍標準的擴張期囊胚人工皺縮后進行冷凍保存。

1.2.1 實驗分組 人工皺縮后囊胚組和同期行胚胎凍融的卵裂期胚胎組。

1.2.2 囊胚的人工皺縮 采用注射針抽穿法行人工皺縮，即用TPC持卵針固定擴張期囊胚，使內細胞團位置位于6點附近，Humagen注射針從2點附近進入，進入點在兩個滋養層上皮細胞的連接處，穿透囊腔后抽出，囊胚自然皺縮。

1.2.3 胚胎冷凍與復蘇 人工皺縮后囊胚冷凍保存方法與卵裂期胚胎相同，采用常規的慢速程序化冷凍法，冷凍保護劑為1.5 M丙二醇和0.1 M蔗糖，程序降溫儀使用FREEZE CONTROL(CL-8800i，澳大利亞)。復蘇法采用快速法。對于卵裂期胚胎，復蘇后至少有半數以上卵裂球完整視為存活。對于囊胚，復蘇后培養2～4 h，囊胚重新擴張到具有正常內細胞團和滋養外胚層形態視為存活。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，采用χ2檢驗比較兩組復蘇率，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

囊胚組解凍囊胚87枚，存活70枚，復蘇存活率為80.46%(70/87)，卵裂期胚胎組解凍胚胎186枚，存活154枚，復蘇存活率為82.80%(154/186)，兩組比較差異無統計學意義(χ2=1.105，P＞0.05)。

3 討論

慢速程序化冷凍是一種平衡冷凍法，通過交換細胞內外液體從而減少在冷凍過程中因滲透平衡出現問題對細胞造成的損傷。程序化冷凍中使用的冷凍保護劑濃度相對較低，不會對胚胎造成嚴重的毒性及滲透損傷，因此被認為是一種安全的冷凍方法。近年來發展迅速的玻璃化冷凍法是一種非平衡冷凍法，與程序化冷凍法相比具有便捷、冷凍效果好等優點，但其缺點在于使用的高濃度冷凍保護劑增加了對胚胎的毒性作用，并且有潛在的生物污染可能。有文獻報道，慢速程序化冷凍法經改良后對于卵裂期胚胎凍存可達到與玻璃化冷凍相當的效果[4-5]。多年來本中心一直用慢速程序化法冷凍胚胎，對于卵裂期胚胎也一直有著較高的復蘇存活率及移植妊娠率。隨著囊胚培養和囊胚移植的快速發展，囊胚的冷凍保存成為輔助生殖領域新的研究熱點。理論上囊胚腔擴張程度越大其種植潛能越高，然而擴張期囊胚冷凍后復蘇效果卻不及早期囊胚，囊胚腔的擴張程度明顯影響其冷凍效果[6]。囊胚的顯著特點就是其囊腔內充滿液體，在與冷凍保護劑作用過程中，囊胚脫水皺縮速度較卵裂期胚胎要慢，囊胚腔越大，囊胚液就越多，就越可能減弱冷凍保護劑的作用而導致脫水不充分，在降溫及復溫過程中囊胚細胞內就更有可能形成冰晶從而影響冷凍效果[7]。為此，有學者依據囊胚的特點，提出人工皺縮的解決辦法，通過減少囊腔的液體量以避免因脫水不充分形成冰晶而造成的機械損傷。即在玻璃化冷凍前，用玻璃微細管反復吹打、顯微針刺入囊胚腔抽吸及激光打孔、顯微針在滋養層上打孔等人工皺縮的方法來減少囊胚腔容積[8-10]。這些研究結果均表明，人工皺縮能明顯提高囊胚的玻璃化冷凍效率，提高復蘇后囊胚在體外及體內的繼續發育能力。本研究中，經顯微注射針刺穿囊胚腔使其自然皺縮后，用慢速程序化冷凍方法保存，快速法解凍，囊胚復蘇率同樣可以達到與卵裂期胚胎相當水平。因此，囊胚在經過顯微注射針人工皺縮預處理后再進行慢速程序化冷凍行之有效，可應用于臨床。

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R714.13

B

1003—6350（2015）07—1048—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0375

2014-09-18)

柳朝華。E-mail：liuxu8007@163.com