Tagalsin對小鼠皮下移植肝癌微血管生成抑制作用

王萌，宋修岐，徐飛

(青島大學醫學院第二附屬醫院普外科，山東 青島 266042)

?

Tagalsin對小鼠皮下移植肝癌微血管生成抑制作用

王萌，宋修岐，徐飛

(青島大學醫學院第二附屬醫院普外科，山東 青島 266042)

目的 探討Tagalsin(角果木提取物)在小鼠皮下移植性肝癌組織中抗微血管生成活性和對腫瘤生長的抑制作用。方法 利用鼠源性H22肝癌細胞建立小鼠皮下移植性肝癌模型，模型成功后隨機將小鼠分為空白對照組和高、中、低濃度Tagalsin組4組，比較小鼠實驗前后體質量變化，計算抑瘤率，檢測瘤組織中促血管生成素-1(Ang-1)、促血管生成素-2(Ang-2)表達水平及兩者比值，計數微血管密度(MVD)。結果 與空白對照組比較，Tagalsin各劑量組腫瘤生長均較緩慢，瘤質量減小(F=1 588.76,t=36.42～75.11,P<0.05)，其高、中、低劑量組抑瘤率分別為37.03%、33.90%、29.92%。免疫組化結果顯示，Tagalsin各劑量組、空白對照組間Ang-1、Ang-2陽性表達率及Ang-2/Ang-1比值比較差異均有顯著性(F=135.81～355.39，t=2.29～47.15，P<0.05)。Tagalsin各劑量組、空白對照組間MVD隨Tagalsin劑量的增加而遞減，差異均有顯著性(F=169.27，t=20.39～45.78，P<0.05)。結論 Tagalsin有抑制腫瘤生長的作用，其機制可能是通過調節Ang-1、Ang-2蛋白的表達，從而影響腫瘤組織中微血管的生成。

肝腫瘤；Tagalsin；促血管生成素-1；促血管生成素-2；新生血管化,病理性

原發性肝癌是消化系統腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，每年我國約有22萬人死于肝癌[1]。腫瘤的生成、生長與轉移與腫瘤性血管的生成有密切關系，而腫瘤性血管的生成依賴于腫瘤性的血管生長因子[2]。從腫瘤的生物學特征來看，肝癌屬于惡性程度高的血管依賴性腫瘤，其生長快、轉移早的必須條件之一是腫瘤血管的生成。Tagalsin(角果木提取物)可通過下調bcl-2和Survivin蛋白的表達，從而導致腫瘤細胞的凋亡，具有抑制腫瘤細胞生長的作用[3]。本實驗研究不同劑量的Tagalsin對小鼠皮下移植性肝癌組織中微血管生成的影響，從而探討其抗腫瘤的機制，為Tagalsin的臨床應用提供理論依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

SPF級昆明種小鼠共70只，雄性，體質量30～32 g，由青島市藥檢所提供。肝癌細胞購自中國海洋大學藥理研究所；Tagalsin購自北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，原濃度20 g/L，用食用油稀釋成0.24、1.20、6.00 g/L備用。RPMI-1640培養基及胎牛血清購自Gibco公司；兔抗小鼠促血管生成素-1(Ang-1)、促血管生成素-2(Ang-2)免疫組化多克隆抗體、兔抗小鼠CD34免疫組化多克隆抗體、即用型SABC超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 選取接種H22肝癌細胞后8～10 d、腫瘤生長良好的荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,采集腹水(呈乳白色濃稠液),置于已消毒的燒杯內,加生理鹽水稀釋使細胞密度達到2×109/L；然后于每只小鼠右前肢腋窩處皮下常規接種瘤細胞懸液0.2 mL，制成局灶性實體瘤實驗模型。

1.2.2分組及給藥 在小鼠接種后8～10 d，可明顯觀察到皮下移植瘤的生長，此時將已建立皮下移植瘤模型的小鼠隨機分為4組： 空白對照組與Tagalsin低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只小鼠?？瞻讓φ战M每天灌胃給予相等體積食用油，低劑量組每天灌胃給予Tagalsin 0.66 mg/kg，中劑量組每天灌胃給予Tagalsin 3.30 mg/kg，高劑量組每天灌胃給予Tagalsin 16.50 mg/kg，連用5 d、停用2 d為一療程，共2療程。停藥后觀察24 h，并稱取各劑量組小鼠體質量，然后脫頸處死小鼠。

1.2.3抑瘤率計算及標本的制作 完整剝離瘤體并稱質量，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-劑量組平均瘤質量/空白對照組平均瘤質量)×100%[3]。取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小腫瘤組織，置于40 g/L的甲醛溶液中固定2 h，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.2.4移植瘤組織中Ang-1、Ang-2及微血管密度(MVD)表達的檢測 將上述石蠟標本行8 μm厚連續切片，烘干，脫蠟抗體修復后免疫組化染色，嚴格按照SABC試劑盒說明書步驟操作，部分切片滴加0.1 mol/L的PBS代替一抗作為陰性對照。陽性結果判斷：Angs陽性染色為棕黃色顆粒狀或線網狀，分布于細胞漿和胞膜。高倍鏡(400倍)下隨機選擇4個強免疫反應視野，循序計數≥1 000個腫瘤細胞中陽性細胞的個數，計算陽性率及Ang-2/Ang-1比值[4]。CD34陽性染色定位于血管內皮細胞，呈棕黃色，腫瘤組織內孤立的棕黃色血管內皮細胞或細胞簇，代表一條單獨的微血管。在10倍物鏡下挑選微血管分布最高的區域，然后在40倍物鏡下(每視野0.196 mm2)計數5個視野中被CD34染成棕黃色的血管數目，取其平均值作為MVD。分辨不清或染色模糊的細胞不計入[5]。

2 結 果

2.1各組小鼠瘤質量及抑瘤率比較

與空白對照組小鼠瘤質量為(3.51±0.06)g相比較，Tagalsin低、中、高劑量組瘤質量分別為(2.48±

0.05)、(2.32±0.07)、(2.21±0.06)g，差異均有顯著意義(F=1 588.76,t=36.42～75.11,P<0.05)；高、中、低劑量組的抑瘤率分別為37.03%、33.90%和29.92%。

2.2各組Ang-1、Ang-2表達情況及Ang-2/Ang-1比值比較

免疫組化結果顯示，Tagalsin各劑量組Ang-1、Ang-2陽性表達率及Ang-2/Ang-1比值與空白對照組比較差異均有顯著性(F=135.81～355.39，t=2.29～47.15，P<0.05)。見表1。

組 別nAng-2(χ/%)Ang-1(χ/%)Ang-2/Ang-1比值空白對照組1575.38±2.1436.59±2.842.03±0.14低劑量組1565.17±2.4154.86±3.441.21±0.13中劑量組1557.57±2.2865.77±3.510.91±0.11高劑量組1549.11±1.5176.17±4.510.72±0.09

2.3各組MVD表達比較

Tagalsin低、中、高劑量組MVD分別為51.23±22.84、33.96±19.37、24.51±12.74，與空白對照組(89.37±31.84)比較差異均有顯著性(F=169.27，t=20.39～45.78，P<0.05)。

3 討 論

Angs 家族是近年來研究發現的一個既含有受體抑制劑，又含有受體激動劑的促血管生成家族。其中Ang-1、Ang-2對血管生成的調節作用效果突出，兩者主要參與新血管的成熟及維持血管的穩定性[6]。FUJIKAWA等[7]通過分析敲除Ang-1基因和Tie-2受體的小鼠模型發現，其新生的血管系統沒有進一步的塑形，血管擴張且通透性高，尤其是在大血管中表現尤為明顯。CHITRA等[8]研究顯示，Ang-1可以拮抗不論是VEGF還是其他的炎性因子誘導的漏出作用，這種作用可能與Ang-1在內皮細胞和周圍支持細胞及基質之間的優化作用相關聯。THURSTON等[9]建立了一種Ang-1過度表達的小鼠模型，研究表明，這些小鼠模型的內皮間質細胞和內皮細胞、周圍支持細胞間的連接完整，小血管數量多且管腔大。Ang-2主要在內皮細胞及腫瘤細胞中表達，與其受體Tie-2有較高的親和力，兩者相結合后，并不是使Tie-2磷酸化，而是使其脫磷酸化，即Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，能完全抑制Ang-1激活Tie-2的效應[10]。HOLSH等[11]研究顯示，Ang-2可通過拮抗Ang-1的作用從而誘導Tie-2的脫磷酸化，使其發生退行性變，導致血管數目減少，血管發生斷裂并伴內皮細胞的凋亡。以往有研究證實，Ang-2/Ang-1的比值可能是決定腫瘤血管生成和腫瘤生長的最終因素。當Ang-2高表達而Ang-1低表達時，促進腫瘤血管的生成，從而推測Angs及其受體系統在腫瘤血管生成中的調節作用以Ang-2的作用為主導。綜上所述，我們可以得出如下結論：Ang-2與Ang-1在調控腫瘤組織中微血管表達時主要表現為兩種形式：①Ang-2結合內皮細胞上的Tie-2，阻斷Ang-1引導的Tie-2受體的磷酸化作用；②腫瘤組織中Ang-1表達的下調和Ang-2的過表達，可以破壞血管生成調節因子的平衡，兩種形式共同作用，誘導內皮細胞分裂、移位，使新生血管呈非出芽式生長，參與腫瘤血管生成。

本實驗在建立小鼠皮下移植性肝癌模型前提下，灌胃給予不同劑量的Tagalsin進行干預，通過與空白對照組比較，顯示小鼠皮下移植瘤生長速度與Tagalsin呈一定的濃度依賴性，即高濃度組的移植瘤生長最為緩慢。免疫組化檢測結果顯示，隨著Tagalsin濃度升高，Ang-1表達增加，Ang-2及MVD表達逐漸減少，且Ang-2/Ang-1的比值亦減小，各組間差異均具有顯著性。根據結果我們推測，Tagalsin可能通過下調Ang-2的表達、上調Ang-1的表達，從而使Ang-2/Ang-1的比值降低，達到減少腫瘤組織中微血管的數目，從而達到抑制腫瘤組織生長的目的。但對于該藥的最適濃度及其對免疫組織器官的副作用還有待進一步研究。

[1] 錢駿,馮敢生. 原發性肝癌的綜合介入治療[J]. 中華腫瘤雜志, 2003,25(5):417-419.

[2] FOLKMAN J. The role of angiogenesis in tumor growth[J]. Semin Cancer Boil, 1992,3(2):65-71.

[3] 郭允振,宋修歧,薛偉山,等. 角果木提取物Tagalsin對小鼠艾氏腹水瘤抑制作用的研究[J]. 齊魯醫學雜志, 2012,27(2):107-109.

[4] 楊揚,趙長林,袁俊波,等. 直腸癌組織VEGF和Ang-2表達及其與腫瘤血管形成相關性的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2011,18(19):1532-1536.

[5] MAEDA K, CHUNG Y S, TAKATSYKO S, et al. Tumor angiogenesis as a predictor of recurrence in gastric carcinoma[J]. J Clin Oncol, 1995,13(2):477-481.

[6] STEJSKAL D, KARPISEK M, REUTOVA H, et al. Angiopoietin-like protein4: development, analytical characterization, and clinical testing of a new ELISA[J]. Gen Physiol Biophys, 2008,27(1):59-63.

[7] FUJIKAWA K, DE AOS SCHERPENSEEN I, et al. Role of PI3-kinase in angiopoietin-1 mediated migration and attchment-dependent survival of endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 1999,253(2):663-672.

[8] CHITRA S, PAMELA F J, SYBILL P, et al. Requisite role Angiopoetin-1,a ligand for the Tie receptor,during embryonic angiogenesis[J]. Cell, 1996,87:1171-1180.

[9] THURSTON G, SURI C, SMITH K, et al. Leakage-resistant blood vessles in mice transgenically overexpressing angiopoietin-1[J]. Science, 1999,286(5499):2511-2514.

[10]TAKAHASHI Y, NISHIKAWA M, TAKAKURA Y. Inhibition of tumor cell growth in the liver by RNS interference-mediated suppression of HIF-1 alpha expression in tumor cells and hepatocytes[J]. Gene Ther, 2008,15(8):572-582.

[11]HOLSH J, MAISONPIERRE P, COMPTON D, et al. Vessel cooption,regression,and growth in tumors meditate by angiopoietins and VEGF[J]. Science, 1999,284(5422):1994-1998.

(本文編輯 厲建強)

ANTI-TUMOR EFFECT OF TAGALSIN ON HEPATOMA

WANGMeng,SONGXiuqi,XUFei

(Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266042, China)

ObjectiveTo explore the effect of Tagalsin (extracted from Ceriops tagal) on antiangiogenesis activity and inhibition of hepatoma in rats.MethodsA subcutaneously transplanted liver cancer model was created in rats using H22 hepatoma cells. Upon completion of the models, the rats were randomized to blank, high-dose-, moderate-dose- and low-dose-Tagalsin groups. Body weight of the rats before and after experiment was compared, tumor inhibition rate was calculated, Ang-2, Ang-1 and Ang-2/Ang-1 ratio were detected, and MVD counted.ResultsCompared with the blank group, tumor growth in each Tagalsin group was slow (F=1 588.76,t=36.42-75.11,P<0.05), and the inhibition rates of tumor in high-, moderate- and low-dose groups were 37.03%, 33.90%, and 29.92%, respectively. Immunohistology showed the differences between each dose group and the blank group were significant with regard to Ang-1,Ang-2 and Ang-2/Ang-1 ratio (F=135.81-355.39,t=2.29-47.15,P<0.05), The levels of MVD in each dose group decreased along with the increase of the dose of Tagalsin, compared with the blank group, the differences were significant (F=169.27,t=20.39-45.78,P<0.05).ConclusionTagalsin has an inhibition effect on tumor growth by likely through adjusting the expressions of Ang-2 and Ang-1, and thus impact the growth of capillaries in tumor tissue.

liver neoplasm; Tagalsin; angiopoietin-1; angiopoietin-2; neovascularization, pathologic

2014-05-16;

2014-09-27

王萌(1986-)，男，碩士研究生。

宋修岐(1953-)，男，教授，博士生導師。E-mail:songxiuqi8@126.com。

R73-36

A

1008-0341(2015)01-0012-03