microRNA-137對人胃癌MKN-45細胞遷移侵襲的影響

劉曉陽，鄭海倫，任 志，張 磊

microRNA-137對人胃癌MKN-45細胞遷移侵襲的影響

劉曉陽1，2，鄭海倫2，任 志2，張 磊1

目的研究miR-137過表達對人胃癌MKN-45細胞遷移侵襲的影響。方法采用RT-PCR法檢測5株胃癌細胞和人胃黏膜上皮細胞（GES）中miR-137的表達。構建miR-137慢病毒，并轉染MKN-45細胞。通過劃痕實驗、細胞侵襲小室檢測和Transwell侵襲實驗以分析過表達miR-137對MKN-45細胞遷移侵襲的影響。結果MKN-45細胞中miR-137的表達豐度明顯低于在GES、MKN-74、AGS、SGC-7901和BGC-823細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。同時成功構建micro up病毒感染的細胞組。劃痕實驗結果顯示，與空白對照組（CON組）和陰性對照組（NC組）比較，micro up組24、48 h后平均遷移率差異有統計學意義（P＜0.05）；細胞侵襲小室檢測結果顯示，與CON組、NC組比較，micro up組的平均遷移率差異有統計學意義（P＜0.01）；Transwell侵襲實驗結果顯示，與CON組、NC組比較，micro up組平均遷移率差異有統計學意義（P＜0.01）。結論miR-137過表達能明顯抑制人胃癌MKN-45細胞遷移侵襲能力，有可能成為胃癌治療的新靶點。

胃癌；miR-137；MKN-45；細胞侵襲

microRNA（miR）是長度約18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，越來越多的研究［1-2］提示miR幾乎參與調控所有人類已知的細胞進程，在功能上充當癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤的發生和發展中起著重要的調控作用。胃癌是人類的常見惡性腫瘤。該研究通過在人胃癌MKN-45細胞中轉染miR-137使其過表達，探討miR-137對胃癌細胞侵襲和轉移能力的影響，進一步揭示miR-137在胃癌細胞中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料has-miR-137、永生化正常人胃黏膜上皮細胞（GES）、人胃癌細胞系（AGS、BCG-823、MKN-45、MKN-74、SGC-7901）、Primer（R＆F）購自上海吉凱基因化學技術有限公司；Trizol、Opti-MEM購自美國Invitrogen公司；DNTPs、Rnase Inhibitor、MMLV購自美國Promega公司；DMSO購自上海生物試劑廠；Oligo dT購自上海生工公司；SYBR Master Mixture、Real-Time PCR（RT-PCR）儀器購自日本TaKaRa公司；胎牛血清FBS、DMEM購自美國Gibco公司；胰酶購自上海化學試劑公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；Nanodrop分光光度計購自美國Thermo公司；穩壓電泳儀購自上海天能公司；熒光顯微鏡購自日本奧林帕斯公司；CO2培養箱購自日本三洋公司；生物安全柜購自上海振樣創空氣凈化設備有限公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR實驗 抽提總RNA（根據Trizol操作說明書進行）；逆轉錄RNA獲得cDNA（根據MMLV操作說明書進行）；按比例配置反應體系，兩步法進行RT-PCR，并制作熔解曲線；分析ΔCt值（ΔCt＝目的基因Ct值-內參基因Ct值）。PCR產物電泳圖見圖1。

1.2.2 慢病毒感染 實驗分為空白對照組（CON組）、陰性對照組（NC組）、micro up組。將胃癌細胞MKN-45復蘇，用胰酶消化液將生長90%匯合的細胞進行傳代。取處于對數生長期的目的細胞消化后制成細胞懸液接種于6孔板中，在37℃、5%CO2培養箱培養待細胞融合度達到約30%，根據細胞感染復數值，加入適宜量的病毒（LV-hsa-miR-137），觀察細胞毒性作用，適時更換培養基。感染3 d后觀察慢病毒報告基因綠色熒光蛋白的表達情況，熒光率大于80%者，將細胞分成兩份，一份分于12孔培養板中待長滿后收集細胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待長滿后收集細胞用于蛋白提取。

1.2.3 劃痕實驗 按照實驗設計的組別，在孔中加入約5×104個感染后的細胞。第2天上午換低濃度血清培養基，使用劃痕儀對準96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用無血清培養基輕輕漂洗2遍，加入低濃度血清培養基，拍照0 h圖片。放入37℃、5%CO2培養箱培養。熒光顯微鏡于24、48 h拍照。根據劃痕后的圖片，計算各組細胞遷移率（遷移率為不同拍照觀察時間點遷移距離與“0 h”劃痕區域寬度值的比值），比較差異。

1.2.4 細胞侵襲小室實驗 從-20℃冰箱中取出所需數目的小室到新的24孔板中，恢復到室溫。在小室和下室中各加500 μl、37℃溫育無血清培養基，37℃培養箱中放置2 h。對細胞懸液進行細胞計數。加750 μl 30%FBS培養基到下室中，加500 μl細胞懸液到每個小室中。在37℃培養箱培養64 h。去除培養基，移去非侵襲細胞。將小室浸泡在Gimesa染色液中30 min，在膜的下表面染色侵入細胞。沖洗晾干小室。給小室整體拍照，顯微鏡拍照膜，用酶標儀在570 nm波長處進行光密度（optical density，OD）值檢測，計算各組侵襲率，比較差異。

1.2.5 Transwell實驗 按實驗分組將3組細胞計數后以1×105／室鋪于一空24孔板中。加600 μl含30%FBS培養基到下室中。用無血清培養基按一定比例稀釋細胞，加該細胞懸液100 μl到每個小室中。將小室轉移入含30%FBS培養基的下室中。在組織培養箱中培養48 h。去除培養基，移去非轉移細胞。加400 μl染色液到24孔板的空孔中，將小室浸泡在染色液中20 min，在膜的下表面染色轉移細胞。沖洗晾干后，用顯微鏡拍照膜，用酶標儀在570 nm波長處進行OD570值檢測，計算遷移率，比較各組差異。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，組間數據資料比較采用成組設計的方差分析。

2 結果

2.1 RT-PCR法檢測hsa-miR-137在MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823及GES的表達情況當ΔCt值≤12時，該細胞中基因表達豐度為高；當12＜ΔCt值＜16時，該細胞中基因表達豐度為中；當ΔCt值≥16時，該細胞中基因表達豐度為低。hsa-miR-137在GES中的表達豐度為中，在MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中的表達豐度為低，而在MKN-45表達豐度最低，與GES及其余幾種胃癌細胞比較差異有統計學意義（F＝358.00，P＜0.05）。故選擇研究hsa-miR-137在MKN-45細胞中的生物學功能。見圖2。

2.2 慢病毒感染培養生長狀態良好的目的細胞，按實驗設計的組別加入慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。感染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。見圖3。

2.3 細胞劃痕實驗檢測miR-137對胃癌MKN-45細胞運動侵襲能力影響分別計算CON組、NC組、micro up組3組細胞24、48 h的遷移率。結果顯示，micro up組24 h后平均遷移率（0.27），與CON組（0.38）和NC組（0.37）比較差異有統計學意義（F＝4.44，P＜0.05）；micro up組48 h后平均遷移率（0.40），與CON組（0.53）和NC組（0.54）比較差異有統計學意義（F＝6.54，P＜0.05）。結果提示，過表達miR-137對MKN-45細胞遷移的能力有抑制作用。見圖4。

2.4 細胞侵襲小室實驗結果通過對CON組、NC組及micro up組進入下室的細胞數量進行測定，檢測接種時MTT OD490值、侵襲小室Giemsa染色OD570值及侵襲率。結果顯示，micro up組的平均遷移率（0.548），與CON組（0.983）和NC組（1.022）比較差異有統計學意義（F＝58.77，P＜0.01）。實驗結果顯示過表達miR-137對于MKN-45細胞的遷移能力有抑制作用。見圖5。

2.5 Transwell侵襲實驗結果通過檢測CON組、NC組及micro up組接種時MTT OD490值、Transwell小室Giemsa染色OD570及Transwell轉移率。結果顯示micro up組的平均遷移率（0.250），與CON組（0.488）和NC組（0.492）比較差異有統計學意義（F＝32.02，P＜0.01）。此結果顯示過表達miR-137對MKN-45細胞遷移的能力有一定抑制作用。見圖6。

3 討論

miR是一類內源性非編碼、長度約22個核苷酸的小RNA，參與生命過程發育、分化、增殖及凋亡等重要進程。根據生物學家的統計推測，miR調節著約60%的人類編碼基因［3］，其中超過50%的miR基因在功能上與腫瘤的發生發展有著密切的關系［4］。

我國為胃癌的高發國家，通過探討研究胃癌細胞生物學功能對更深入的闡明胃癌發生發展機制具有著重要的意義。有些miR在胃癌中呈低表達，如miR-182［5］和miR-429［6］等，另外一些miR在胃癌中呈高表達，如miR-130b［7］和miR-23a［8］等。而隨著研究的深入，miR對于胃癌細胞生物學功能的調節作用被進一步揭示，如miR-146a在胃癌細胞中高表達，通過下調SMAD4基因表達水平促進胃癌細胞生長［9］。miR-145可抑制胃癌細胞的遷移侵襲［10］。

miR-137是人類細胞中發現較早，存在很廣泛的一種miR。近期研究顯示，miR-137在很多腫瘤組織中呈低表達，參與調控了腫瘤細胞的多種生物學功能，如miR-137可以抑制腦膠質瘤細胞增殖和侵襲［11］，與結直腸癌的預后和侵襲密切相關［12］，還可以抑制肺癌細胞的增殖［13］。本研究通過RT-PCR實驗檢測miR-137在各種胃癌細胞中的表達豐度，結果顯示相對于GES，miR-137在多種胃癌細胞（MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823）中呈低表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。而miR-137在MKN-45中表達豐度最低，與各組胃癌細胞比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。miR-137在多種胃癌細胞中的低表達，提示miR-137可能在胃癌的發生發展中發揮著重要作用。為了明確miR-137在胃癌轉移侵襲中發揮的重要作用，進行了細胞劃痕實驗、細胞侵襲實驗及Transwell實驗。實驗結果顯示，在過表達慢病毒感染miR-137后，轉染的LV-hsa-miR-137在劃痕實驗、細胞侵襲小室實驗及Transwell侵襲實驗中，micro up組相對于NC組和CON組，差異均有統計學意義。上述實驗結果顯示過表達miR-137對胃癌MKN-45細胞的侵襲遷移能力有抑制作用。

很多文獻已驗證miR-137的靶基因包括LSDI［14］，Cdc42［15］等，通過在線軟件（TargetScan.org、microRNA.org、miRDB.org）預測miR-137靶基因顯示，miR-137還有的很多潛在基因如MMP-2、PTP4A3等與腫瘤細胞的侵襲及遷移有關。miR-137可通過對這些靶基因的調控來影響胃癌細胞的相關細胞學功能。

探索miR-137如何參與及調控胃癌細胞的各項生物學功能，對于胃癌早期診斷、預后評價及治療均具有重要意義。本研究結果提示，胃癌細胞中miR-137基因的低表達，抑制胃癌細胞的遷移侵襲作用，miR-137可能成為胃癌診斷的新指標，成為胃癌基因治療的新靶點。

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Effect of microRNA-137 on migration and invasion of MKN-45 cells of human gastric cancer

Liu Xiaoyang1，2，Zheng Hailun2，Ren Zhi2，et al（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 233022；2Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003）

ObjectiveTo study the effectiveness of over expression of miR-137 on migration and invasion of human gastric cancer MKN-45 cells.MethodsRT-PCR technique was explored to detect the expression of miR-137 of 5 strain of gastric cancer cell and human gastric epithelium.Constructed lentivirus vector of overexpressing miR-137.Scratch test，cell invasion chamber test and Transwell invasive test were used to analyze the effectiveness of overexpression of miR-137 on migration and invasion of human gastric cancer MKN-45 cells.ResultsThe degree of expression of miR-137 in MKN-45 was obviously lower than those in GES，MKN-74，AGS，SGC-7901 and BGC-823 cells and the difference was significant（P＜0.05）.The lentivirus vector of micro up miR-137 infected cells group was successfully built.Scratch test result showed that the average migration rates after 24，48 h of micro up group compared with CON group and NC group，the difference was significant（P＜0.05）.The Results of cell invasion chamber test and Transwell invasive test all showed that the average metastatic rates of micro up group compared with CON group and NC group，the difference was significant（P＜0.01）.ConclusionMicro up miR-137 could inhibit distinctively the ability of migration and invasion of human MKN-45 cell strain and might be a novel target point for treatment of gastric cancer.

gastric cancer；miR-137；MKN-45；invasion

R 735.2

A

1000-1492（2015）12-1748-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.018.html

2015-09-08接收

安徽高等學院省級自然科學研究項目（編號：KJ2012B103）

1安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科，合肥 230022

2蚌埠醫學院第一附屬醫院消化科，蚌埠 233003

劉曉陽，男，主治醫師；

張 磊，女，副教授，主任醫師，碩士生導師；責任作者；E-mail：chinazhanglei＠163.com