雞肌肉組織實時熒光定量PCR及Western雜交內參基因的篩選

王紅楊，劉冉冉，趙桂蘋，鄭麥青，李慶賀，李 鵬，劉 麗，文 杰

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

雞肌肉組織實時熒光定量PCR及Western雜交內參基因的篩選

王紅楊，劉冉冉，趙桂蘋，鄭麥青，李慶賀，李 鵬，劉 麗，文 杰*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

本研究對5種常用“持家基因”作為雞肌肉組織發育早期基因和蛋白檢測內參基因的有效性進行了評價，為雞肌肉發育相關分子檢測中內參基因的選擇提供科學依據。應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技術，分別檢測了雞12胚齡、17胚齡、1日齡和14日齡胸肌中β肌動蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA結合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和熱休克蛋白70(HSP70)的mRNA和蛋白表達水平。結果表明，在雞發育早期胸肌組織中，僅HSP70 mRNA和蛋白在各階段間表達水平差異不顯著，GAPDH、TUBB、TBP和ACTB的mRNA和蛋白表達水平在檢測的各個時間點間均差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。HSP70更適合作為雞肌肉發育早期基因和蛋白檢測的內參基因。本結果為研究發育期雞肌肉組織相關功能基因和蛋白提供了必要的方法學基礎，對其他物種的相關研究也有重要借鑒意義。

雞；肌肉組織；早期發育階段；實時熒光定量PCR；Western雜交；內參基因

實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western雜交是相對定量組織或細胞中特定基因或蛋白表達水平的常用技術，廣泛應用于基因功能等分子生物學基礎研究、轉基因產品檢測、抗體活性檢測和疾病早期診斷等方面[1-3]。在實際操作中，RNA或蛋白濃度測定、加樣、反轉錄或轉膜效率等都有可能導致RT-qPCR和Western雜交上樣量的差異，這就需要用內參基因對上樣量進行校正[4-7]。理想的內參基因或蛋白是表達水平維持恒定或不受試驗條件和機體發育變化影響的一類基因或蛋白，通常為持家基因或其所表達的蛋白。β肌動蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA結合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核纖層蛋白B1(LMNB1)、組蛋白H3(H3)、ATP合成酶亞基(ATP1A)等持家基因因其在各種組織、細胞中均表達且表達水平相對恒定而常作為內參基因。然而，部分持家基因的mRNA或蛋白表達水平可能會隨著機體發育變化而產生差異。M.Bionaz等[8]發現，不同泌乳階段奶牛乳房中ACTB和GAPDH的mRNA表達水平差異較大；S.Mamo等[9]發現體內外培養不同發育階段小鼠胚胎中ACTB的mRNA表達水平差異較大；M.Rocha-Martins等[10]發現，ACTB蛋白表達水平隨著大鼠視網膜的發育明顯下降。因此，特定試驗條件下，內參基因的選擇就成為試驗的關鍵點和難點。目前，有關雞肌肉組織不同發育時期基因及蛋白檢測內參基因的研究尚未見報道，制約了肌肉發育分子機制等相關研究的開展。

本研究通過對北京油雞胚胎期至生長早期胸肌4個時間點、5個持家基因的mRNA和蛋白表達水平比較研究，旨在篩選出穩定表達的內參基因，為今后肌肉生長發育、肉質性狀和疾病性狀相關功能基因及蛋白的挖掘和功能驗證提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中的北京油雞種蛋和雛雞來自于中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所昌平試驗基地。在12胚齡(Ed 12)、17胚齡(Ed 17)、1日齡(1 d)、14日齡(14 d)分別隨機選擇3只，取其雙側胸肌組織。所采集樣本迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存備用。

1.2 總RNA提取

利用總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取各日齡胸肌組織總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性，并經核酸定量儀NanoDrop2000(Thermo scientific，美國)測定濃度及根據A260 nm/A280 nm值確定RNA純度。

1.3 PCR引物設計

根據定量PCR引物設計原則，利用Primer Premier 5.0軟件，分別設計ACTB、TUBB、TBP、GAPDH和HSP70等5個候選內參基因的定量PCR引物，并由華大基因科技有限公司合成。引物信息如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR檢測所用5個候選內參基因的引物信息

1.4 cDNA合成和實時熒光定量PCR

cDNA反轉錄參照PrimerScriptTM RT Master Mix(Perfect Real time)試劑盒(TaKaRa，美國)操作說明進行，-20 ℃保存備用。RT-qPCR參照KAPA SYBR?FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal(KAPA，美國)試劑盒說明書進行。每個樣品3個技術重復。

1.5 總蛋白提取和濃度測定

取100 mg左右胸肌組織，加入20倍體積的RIPA裂解液(碧云天，上海)，用干凈剪刀將組織剪碎，然后置于2 mL玻璃勻漿器中進行勻漿，勻漿后冰上靜置30 min，不時搖晃。4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液。所得樣品總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo scientific，美國)測定蛋白濃度，并用1×PBS緩沖液將蛋白濃度均一化為2 μg·μL-1，分裝，-80 ℃保存備用。

1.6 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(康為世紀，北京)制備分離膠濃度為12%、濃縮膠濃度為5%、厚度為1.5 mm的配制膠。將蛋白樣品與5×還原型SDS-PAGE上樣緩沖液(康為世紀，北京)以4∶1進行混合，95 ℃金屬浴10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液并分裝，-20 ℃保存備用。取20 μL即32 μg總蛋白上樣，樣品依次為蛋白分子量標準(Thermo scientific，美國)，Ed 12、Ed 17、1 d和14 d胸肌總蛋白樣品。初始電壓80 V，約30 min后樣品壓成一條細線，提高電壓至120 V，繼續電泳直至溴酚藍泳出分離膠下緣。

1.7 轉膜和封閉

將大小適中的PVDF膜(0.22 μm，Millipore，美國)無水甲醇浸泡5 min；膠純水浸泡5 min，然后將PVDF膜、膠、濾紙、夾子和海綿(Bio-Rad，美國)在轉膜液中浸泡10 min。按照黑板→海綿→濾紙→膠→膜→濾紙→海綿→白板的順序制作“三明治”，確保每層之間沒有氣體。200 mA轉膜90 min。轉膜后采用5%脫脂奶粉(BD，美國)室溫搖床封閉1 h。TBST洗膜2次，TBS洗膜1次，每次5 min。

1.8 抗體孵育和顯影

ACTB(abcam，ab8227，英國，1∶3 000)、TUBB(abcam，ab6046，英國，1∶500)、TBP(Millipore，MAB3658，美國，1∶3 000)、GAPDH(abcam，ab22555，英國，1∶10 000)、HSP70(abcam，ab69412，英國，1∶2 000)4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜4次，TBS洗膜2次，每次5 min。羊抗兔二抗-HRP(康為世紀，北京)或羊抗鼠二抗-HRP(碧云天，上海)室溫搖床孵育1 h。TBST洗膜4次，TBS洗膜2次，每次5 min。化學發光檢測試劑(Millipore，美國)孵育2 min，于ImageQuant LAS 4000 mini儀器(GE，美國)自動曝光，采集Western雜交圖像。每個時間點3個生物學重復。

1.9 數據分析

根據公式Q=E△Ct計算各基因的相對表達量Q。其中E為基因擴增效率(一般情況下將基因擴增視為理想擴增，擴增效率E默認為2)，△Ct=Ctmin-Ct樣品(Ctmin為每個基因不同樣品中最小Ct值，Ct樣品為每個樣品的Ct值)[11-12]。應用BestKeeper軟件分析候選內參基因的表達穩定度[13]。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Western雜交條帶累積光密度值(IOD)，利用SAS軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 RNA樣品和總蛋白質量檢測

總RNA瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，RNA樣品均有完整帶型的5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。核酸定量儀檢測時A260 nm/A280 nm在2.0左右，A260 nm/A230 nm在2.0～2.4，總RNA提取質量和純度較高，可用于后續試驗。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis

總蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍染色，結果如圖2所示。各泳道蛋白條帶清晰，無高豐度蛋白和雜質，同一時間點樣本生物學重復性較好，但在同一分子量位置蛋白沉積量明顯不同，說明4個時間點因發育變化而蛋白表達模式可能存在較大差異。

圖2 總蛋白考馬斯亮藍染色膠圖Fig.2 Total protein Coomassie blue-stained gel

2.2 候選內參基因的引物檢測

以胸肌cDNA為模板，進行RT-qPCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示，各內參基因擴增片段大小與引物設計預期片段大小一致，無雜帶，引物特異性較好。

1.ACTB；2.TBP；3.HSP70；4.GAPDH；5.TUBB；M.DL2000 DNA marker圖3 胸肌候選內參基因RT-qPCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of RT-qPCR products of candidate reference genes in breast muscle

2.3 候選內參基因相對表達水平及表達穩定度評價

以Ed 12胸肌mRNA表達水平為參照，候選內參基因相對表達水平如表2所示。在發育早期不同日齡胸肌組織中，ACTB、TBP、TUBB和GAPDH的mRNA相對表達水平差異極顯著(P<0.01)，僅HSP70的mRNA相對表達水平在各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

BestKeeper軟件根據各樣品候選內參基因Ct值對樣品進行配對相關分析，計算標準偏差(SD)、變異系數(CV)及各基因間的泊松相關系數。根據SD評估內參基因的表達穩定度，SD越小，基因表達穩定度越高，反之，穩定度越低。發育早期雞胸肌組織5個候選內參基因中，ACTB、TBP、TUBB的SD較大，并高于HSP70和GAPDH(圖4)。從基因相對表達水平和表達穩定度兩方面考慮，HSP70更適合作為發育早期雞胸肌組織的內參基因。

表2 發育早期胸肌候選內參基因的相對表達水平

圖4 發育早期胸肌候選內參基因表達穩定度(BestKeeper)Fig.4 Stability of candidate reference genes in the early developmental stages of breast muscle by BestKeeper

2.4 Western blot結果

在預測分子量42 ku(ACTB)、33 ku(TBP)、50 ku(TUBB)、36 ku(GAPDH)和69 ku(HSP70)處分別檢測到5種蛋白的Western雜交圖像，如圖5(A、C、E、G、I)所示。以Ed 12 IOD為對照，構建柱狀圖(圖5B、D、F、H、J)。胸肌中ACTB、TBP和TUBB蛋白表達水平隨機體發育顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；GAPDH蛋白表達水平隨機體發育逐漸升高，且在14 d的表達極顯著高于1 d(P<0.01)；僅HSP70蛋白表達水平隨機體發育未呈現顯著性變化(P>0.05)。

A、C、E、G和I分別為ACTB、TUBB、TBP、GAPDH和HSP70的Western blot結果；B、D、F、H和J分別為相應IOD分析結果。**.P<0.01；*.P<0.05Western blot results for ACTB (A)，TUBB (C)，TBP (E)，GAPDH (G) and HSP70 (I)；IOD analysis for ACTB (B)，TUBB (D)，TBP (F)，GAPDH (H) and HSP70 (J).** .P<0.01；*.P<0.05圖5 Western blot及IOD分析結果Fig.5 Results of Western blot and IOD analysis

3 討 論

實時熒光定量PCR和Western blot技術是定量基因或蛋白表達水平的常用檢測技術[14-15]。對于Western blot而言，雖然麗春紅染色、Sypro Ruby染色、考馬斯亮藍染色等總蛋白染色法為校正蛋白上樣量提供了一些選擇，但是這些方法存在著效果差、耗時間、靈敏度低和背景高等缺陷[16-18]。因此，選擇合適的內參基因或蛋白對上樣量進行校正是不可或缺的。

本研究表明，HSP70和GAPDH基因表達穩定度較高，ACTB等其他3個基因表達穩定度較差；ACTB、TUBB、TBP和GAPDH在雞不同日齡胸肌組織中mRNA和蛋白表達水平均存在顯著性變化，HSP70 mRNA和蛋白表達水平則無顯著性變化。可能的原因是，對于哺乳動物及家禽骨骼肌發育而言，胚胎期是肌肉細胞數量增加(Hyperplasia)的時期，至出生(出雛)時肌纖維數量已經固定；生長早期則主要是肌肉細胞肥大(Hypertrophy)，即體積增大的時期[19]。此外，隨著胸肌的發育，肌纖維直徑增加，密度減小，IIB型快速酵解纖維比例升高，肌肉的酵解性增強，最終胸肌完全由IIB型快速酵解纖維組成[20-21]，這也可能與ACTB、TUBB、TBP和GAPDH等肌纖維發育相關基因表達不穩定和蛋白表達水平存在發育性變化相關。

HSP70在所有細胞內均能表達，環境中存在高溫、缺氧、饑餓等應激原的情況下，HSP基因即被激活，高效表達[22]。S.Greer等[2]研究發現，HSP90在不同細胞培養密度情況下可以作為內參蛋白。雞是恒溫動物，本研究雞從胚胎發育、出雛到14日齡的過程中，并未受到冷熱應激。雖然HSP70在14日齡胸肌組織中的蛋白分子量大小與其他時間點稍有不同，這可能是蛋白翻譯后修飾原因造成的，但是其蛋白表達水平與其他時間點差異不顯著，相比較其他常規內參蛋白而言，是用于雞發育早期肌肉組織目標蛋白Western blot檢測相對理想的內參基因。

4 結 論

本研究從mRNA和蛋白水平證實HSP70更適合作為發育早期雞胸肌組織實時熒光定量PCR和Western雜交的內參基因。

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(編輯 郭云雁)

Identification of Reference Genes by Real-Time Quantitative PCR and Western Blot in Chicken Muscle Tissues

WANG Hong-yang，LIU Ran-ran，ZHAO Gui-ping，ZHENG Mai-qing，LI Qing-he，LI Peng，LIU Li，WEN Jie*

(StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

This research evaluated the availability of 5 “housekeeping genes”as reference genes for gene expression detection in different early developmental stages of muscle tissues in chicken，which would provide scientific evidences for selecting reference genes in the molecules detection related to muscle development of chicken.Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR) and Western blot were used to test the mRNA and protein levels of β-actin (ACTB)，β-tubulin (TUBB)，TATA-binding-protein (TBP)，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Heat shock 70 kDa protein (HSP70) in breast muscle of chicken at embryonic day 12 and 17，day 1 and day 14 post-hatch，respectively.The results showed that，only mRNA and protein levels of HSP70 didn’t significantly change in the early developmental stages of breast muscle in chicken，while that of other genes significantly altered (P<0.05 orP<0.01).HSP70 was more suitably used as reference gene for gene or protein expression detection in the early developmental stages of muscle tissues in chicken.This study provides methodological basis for functional genes and proteins studies of muscle development in chicken.It also could play a referential role in other species.

chicken；muscle tissues；early developmental stages；Real-Time quantitative PCR；Western blot；reference gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.005

2014-10-10

國家自然基金青年基金項目(31201797)；國家“863”項目(2011AA100301)；中國農業科學院科技創新工程(ASTIP-IAS04)

王紅楊(1991-)，女，河南人，碩士，主要從事單胃動物營養與飼料科學研究，E-mail：wanghy0112@163.com

*通信作者：文 杰，E-mail：wenjie@caas.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)07-1107-07