牛囊胚ICM克隆多能性標記基因與表面標記的研究

崔莉莎，趙學明，郝海生，杜衛華，馬友記，朱化彬*，王宗禮*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

牛囊胚ICM克隆多能性標記基因與表面標記的研究

崔莉莎1，2，趙學明2，郝海生2，杜衛華2，馬友記1，朱化彬2*，王宗禮1*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

本研究旨在探究牛類胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ES)的多能性標記基因與表面標記，為優化牛類ES細胞培養條件和相關研究提供依據。利用2i/LIF培養液，通過全胚接種及機械傳代法分離培養牛囊胚內細胞團(Inner cell mass，ICM)，免疫熒光染色法檢測其多能性標記基因與表面標記；qRT-PCR檢測免疫磁珠法分選的牛囊胚ICM和滋養層細胞(Trophectoderm cell，TE)的多能性標記基因的差異表達結果。試驗成功分離出了牛囊胚ICM克隆，并體外培養至第10代，且各代克隆均呈現出了典型的干細胞形態。結果表明，ICM表面標記SSEA1、SSEA4和TRA-1-60染色為陽性，且多能性標記基因OCT4、SOX2和NANOG在其中均有表達；OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表達存在差異(P<0.05)，其中SOX2 的差異極顯著(P<0.01)。綜上表明，2i/LIF培養液有助于牛囊胚ICM的培養；SOX2可能成為牛ICM克隆的候選多能性標記基因。

牛；ICM；多能性標記；qRT-PCR

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ES)是來源于附植前胚胎內細胞團(Inner cell mass，ICM)、保持未分化狀態并能自我增殖的多能性細胞[1]。ES 細胞具有分化為機體所有細胞的潛力，所以可用于早期胚胎發育的研究[2]。自從M.J.Evans等[3]1981年建立了第1個小鼠 ES 細胞系后，陸續獲得了獼猴[4]、人[5]和大鼠[6]的ES細胞系，牛類ES細胞系也相繼建立[1，7-15]，但是牛ES細胞系尚未成功建立。這主要是由于牛ES細胞多能性維持機理尚不清楚，迄今為止，主要還是借鑒研究小鼠和人ES細胞系的方法研究牛ES細胞。近年來，小鼠和人ES細胞研究取得了巨大進展，其培養條件日趨成熟，ES細胞鑒定標準(如多能性基因和表面標記等)也已比較完善[3，5]。階段特異性胚胎抗原(Stage-specific embryonic antigen，SSEAs)是ES細胞的重要多能性表面抗原標記，其中 SSEA-1已被確認為小鼠 ES 細胞的表面標記，而OCT4、SOX2、NANOG等是可以鑒定小鼠ES細胞的特異多能性基因[3，16]。人ES細胞的表面標記有SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，特異多能性基因有OCT4、SOX2、NANOG等[5]。由于物種間存在差異，這些分子標記并不能鑒定牛ES細胞[17]。因此，探索牛ES細胞的多能性標記基因及其表面標記，揭示維持牛ES細胞多能性的機制，有助于找到適合牛類ES細胞的培養條件，促進牛ES細胞系的成功建立[18]。

免疫磁珠分選法可根據細胞特異表面標記分選細胞，利用這種方法可以獲得高純度的 ICM和滋養層細胞(Trophoblastic cell，TE)[19]。而采用qRT-PCR對獲得的高純度ICM和TE 細胞進行分析，有助于探索牛ICM多能性維持基因[20]。近年來，越來越多的研究開始利用 2i/LIF培養液培養牛類ES細胞，并建立了牛類ES細胞系[14，20-21]，而對所建立的牛類ES細胞系進行免疫熒光染色，檢測多能性基因和表面標記的表達，有助于探索牛ES細胞的多能性調控網絡。因此，本研究采用全胚接種結合機械傳代法分離牛囊胚ICM，并通過免疫熒光染色來檢測其多能性標記基因與表面標記。qRT-PCR檢測免疫磁珠法分選獲得的ICM和TE細胞，篩選ICM特異多能性基因，旨在探究牛類ES細胞多能性標記基因及表面標記，為牛ES細胞研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與溶液配制

TCM199、DMEM和FBS購自Gibco，LH和FSH 購自BIONICHE公司，其余試劑均購自 Sigma公司。卵母細胞成熟液：TCM199+10% FBS+1 μg·mL-1雌二醇+5 μg·mL-1FSH+5 μg · mL-1LH；小鼠胎兒成纖維細胞培養液：DMEM+10% FBS+100 U·mL-1青霉素+0.05 mg·mL-1鏈霉素。

1.2 體外受精囊胚的生產

1.2.1 牛卵母細胞體外成熟培養 將從屠宰場取得的牛卵巢置于32～35 ℃生理鹽水中，保溫2～3 h送到實驗室后，用真空蠕動泵(12號針頭)抽取卵巢表面可見卵泡。撿出含3層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)后，分別用卵母細胞洗液和卵母細胞成熟液洗兩遍，移入四孔板成熟培養液中(每孔750 μL成熟液，50枚COCs)，在5% CO2、37.5 ℃、飽和濕度的培養箱中培養22～24 h。

1.2.2 體外受精 體外受精程序參照文獻[22]的方法進行，略有改動。在35 mm的培養皿中做50 μL的受精微滴，放入培養箱中平衡2 h。將在成熟液中培養22～24 h的卵母細胞移至平衡2 h的受精滴中，每滴15枚。然后取冷凍精液，在38 ℃水中解凍后，用受精液洗兩遍(1 800 r·min-1，每次8 min)后，棄上清液，用受精液懸浮，調整精子密度為1×106mL-1。取50 μL精子懸浮液加入到已放入卵母細胞的50 μL受精微滴中，置于培養箱中培養8 h (5%CO2、38.5 ℃、飽和濕度)。

1.2.3 胚胎體外培養 用0.25%的透明質酸酶消化受精8 h的受精卵，脫除顆粒細胞，用終止液(M199+10% FBS)和胚胎培養液(mCR1aa)[23]各洗2遍后，移入預平衡2 h以上的mCR1aa微滴中培養。48 h后，更換培養液為mCR1aa + 10% FBS，以后隔天半量換液。

1.3 飼養層的制備1.3.1 小鼠胎兒成纖維細胞系的建立 將12.5～13.5 d 的孕鼠頸椎脫臼處死，無菌取其胚胎，去除胎鼠的頭、尾、四肢、內臟，將剩余部分置于無Ca2+、Mg2+的PBS中沖洗1～2次；然后將其剪成1 mm3以下的組織碎塊，加入0.05% trypsin-EDTA，放入培養箱(37.5 ℃、5% CO2、飽和濕度)中消化5 min，待消化完成后反復吹吸混勻。在消化液中加入小鼠胎兒成纖維細胞培養液[24]，終止消化。將單細胞懸液鋪在細胞培養皿中，于培養箱(37.5 ℃、5% CO2、飽和濕度)中培養。每日觀察，隔天換液，3～4 d后傳代。

1.3.2 飼養層的制備 用10 μg·mL-1的絲裂霉素C處理第2代的小鼠胎兒成纖維細胞2～3 h。處理完成后用無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗3～5次，0.25% 的trypsin-EDTA消化1～2 min后，用含有10% FBS的DMEM終止消化，再將細胞懸液離心3 min(1 000 r·min-1)。去上清，加入凍存液(DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1)，按合適密度凍存于液氮中備用。在全胚接種或者牛ICM克隆傳代前一天，將細胞接種于0.1%明膠涂層的6孔板中，放入培養箱(37.5 ℃、5%CO2、飽和濕度)中培養，用作飼養層。

1.4 囊胚的接種

提前0.5 h將飼養層更換為胚胎干細胞培養液[25]，然后將培養7 d的IVF囊胚接種到飼養層上。置于培養箱(38.5 ℃ 5%CO2，飽和濕度)中培養，隔天半量更換培養液，等貼壁后可全量換液。

1.5 ICM的分離與傳代培養

接種7～10 d后，用機械分離法進行第1次傳代：用1 mL注射器的針頭將ICM形成的細胞團塊挑出，并分離為較小的細胞團塊，轉移至新的飼養層上培養。之后每隔5～7 d進行傳代，方法同1.4。

1.6 堿性磷酸酶染色和免疫熒光染色

利用ES細胞鑒定試劑盒(Millipore，USA﹠Canada)進行AP染色和免疫熒光染色。

1.6.1 堿性磷酸酶染色 在中低密度下培養ICM克隆5 d后，用4%多聚甲醛固定1～2 min；棄固定液，1×Rinse buffer沖洗；染色劑(Fast Red Violet Solution∶Naphthol∶Water = 2∶1∶1)在室溫、黑暗環境下培養ICM克隆15 min；棄染色劑，1×Rinse buffer沖洗；加入1×PBS后在顯微鏡下觀察陽性克隆數。

1.6.2 免疫熒光染色 室溫下，4%的多聚甲醛固定ICM克隆15～20 min，1×Rinse buffer洗兩遍(每次5～10 min)；0.1%的Triton X-100透化細胞10 min，1×Rinse buffer洗兩遍(每次5～10 min)；封閉液(3%～5%BSA/TBST)封閉細胞30 min；再用封閉液把一抗稀釋到工作濃度(SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60的稀釋比例為1∶10～1∶50，OCT4、SOX2和NANOG的稀釋比例為1∶100～1∶1 000)，室溫下用一抗培養ICM克隆1 h；1×Rinse buffer洗3遍(每次5～10 min)；用1×PBS稀釋二抗(Rabbit Anti-mouse IgG-Fc/FITC、Goat Anti-mouse IgM/FITC和Mouse Anti-rabbit IgG/PE，稀釋比例均為1∶100～1∶1 000)，用二抗培養ICM克隆30～60 min；1×Rinse buffer洗3遍(每次5～10 min)；加入1×PBS覆蓋細胞后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 牛囊胚ICM和TE的分選

利用免疫磁珠分選法分選牛囊胚ICM和TE，具體參照文獻[19]的方法進行，略有改動。

用結合有FITC的伴刀豆蛋白(ConA)標記已去除透明帶的囊胚滋養層細胞；然后置于含有1 mmol·L-1EDTA 的DPBS (Invitrogen)中5 min，再移入trypsin-EDTA 溶液中，38.5 ℃下培養15 min；渦旋器將其分解成單細胞后，用含有1 mmol·L-1EDTA 和10% FBS 的DPBS來終止；細胞過濾器(BD Biosciences)過濾，收集通過過濾器的單個細胞；加入MACS buffer，500 g離心5 min，110 μL MACS buffer 重懸囊胚細胞；再加入10 μL結合有小鼠anti-FITC IgG1 的磁珠，在冰上、黑暗條件下，培養15 min；MACS 緩沖液洗3次后加入500 μL MACS 緩沖液重懸細胞，使其通過吸附在磁力架上的磁珠分離柱，并收集到離心管中，再用MACS 緩沖液沖洗兩遍磁力柱(每次500 μL)，從而獲得FITC陰性細胞(ICM)；將分離柱從磁力架上拿下后，用MACS 緩沖液沖洗3遍，并收集細胞懸液，從而獲得 FITC陽性細胞(TE)。將分離得到的ICM和TE置于-80 ℃保存。

1.8 qRT-PCR檢測牛囊胚ICM和TE多能性基因的差異表達

將通過免疫磁珠分選法獲得的ICM和TE進行qRT-PCR，檢測OCT4、SOX2和NANOG的表達水平。采用PureLinkTM RNA Micro 試劑盒(Invitrogen)來提取RNA，具體方法參照操作手冊。提取RNA后進行逆轉錄。然后進行熒光定量PCR擴增(引物見表1)，用β-actin作內參基因。PCR的反應體系為25 μL：17.3 μL超純水+2.5 μL 10×buffer + 2.0 μL鎂離子(25 mmol·L-1) + 0.2 μL dNTPs (25 mmol·L-1) + 0.5 μL上游引物(10 μmol·L-1) + 0.5 μL SYBR(20×)+ 0.5 μL下游引物(10 μmol·L-1) + 0.3 μLTaq酶(5 U·μL-1) + 1.2 μL模板(除模板外，均為Invitrogen公司產品)。 PCR反應條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，45個循環。每個樣品重復3次，熒光定量結果采用2-ΔΔCt法[26]進行分析。

表1 qRT-PCR引物

1.9 統計分析

數據采用SAS軟件進行分析，并用ANOVA進行顯著性差異分析，結果用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 牛囊胚ICM分離與培養

將培養7 d 的 IVF 囊胚全胚接種至飼養層上，接種培養 7～10 d 后，機械法將ICM克隆挑出并傳至新的飼養層上，之后每隔5～7 d采用機械法傳代。本試驗將牛囊胚ICM克隆培養至第10代(圖 1)，克隆呈圓頂狀，高度聚集，并有明顯的邊界。

2.2 ICM克隆中多能性標記基因及表面標記檢測

堿性磷酸酶染色(圖2)和免疫熒光染色分別檢測第1代和第10代ICM克隆的多能性基因(OCT4、SOX2和NANOG)和表面標記(SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60)的表達，染色結果均呈陽性(圖3和圖4)。

2.3 牛囊胚 ICM 和 TE 的分選

用磁珠分選法分選牛IVF囊胚得到ICM和TE，經檢測，二者的分離純度均達到90%以上。

2.4 ICM 和 TE 多能性基因的表達

qRT-PCR 驗證免疫熒光染色中呈陽性的多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的表達情況。結果如圖 5 所示，3個基因在 ICM和TE中均可表達，但ICM的表達量均高于TE(P<0.05)，其中SOX2基因表達差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 牛囊胚ICM體外培養及免疫熒光染色

本試驗中第1～10代的牛ICM克隆呈現出了典型的干細胞形態，這表明2i/LIF培養液有助于維持牛ICM克隆的多能性。此外，通過免疫熒光染色檢測表面標記SSEA1、SSEA4 和 TRA-1-60以及多能性基因OCT4、SOX2和NANOG在牛ICM克隆中的表達情況，結果均為陽性，這與已有的研究結果有相同之處[1，12，14-15，21，24]。SSEAs是小鼠和人多能性細胞表達的表面抗原，其中SSEA-1 在小鼠ES細胞中表達量較高[27]，SSEA-3和SSEA-4在人ES細胞中特異表達[28]。此外，OCT4、SOX2和NANOG是小鼠和人多能性細胞的重要標記基因。但是這些多能性分子標記在牛類ES細胞中的表達情況還有待進一步的研究[16]。L.Wang等[12]建立的牛類ES細胞系，表達表面標記 SSEA-4 和多能性基因OCT4；G.Gong等[24]研究結果為在5～7代的牛類ES細胞系中表面標記SSEA-1和多能性標記 OCT4 和NANOG染色呈陽性；而V.Verma等[21]所建立牛類ES細胞系表達表面標記SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60/-81和多能性基因OCT4、SOX2、NANOG、Klf4。T.Furusawa等[14]利用 2i/LIF 培養液建立的牛類ES細胞系表達SSEA-1、SSEA-4和多能性基因OCT4、SOX2、NANOG。關于牛類ES細胞多能性分子標記的研究存在很大差異，這可能是由多方面的因素所致。比如培養條件、傳代方式、飼養層種類以及鑒定方法等[18]。

A～C.胚胎接種第3、4、7 天；D～K.第1～8代ICM克隆；L.第10代ICM克隆A-C.The embryo on the third，fourth and seventh day respectively after seeded onto MEF；D-K.The ICM-derived colonies from passage 1 to passage 8；L.The ICM-derived colonies at passage 10圖1 牛ICM克隆各階段培養狀態圖Fig.1 Morphology of ICM colonies from bovine IVF blastocysts

A、B.第1代牛囊胚ICM克隆；C、D.第10代牛囊胚 ICM 克隆A，B.ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 1；C，D.ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 10圖2 堿性磷酸酶染色Fig.2 Alkaline phosphatase staining

利用免疫熒光染色法檢測的多能性標記SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、OCT4、SOX2和 NANOG。A1～F1、A2～F2和A3～F3.光鏡照片、Hoechst33342標記細胞核以及特異抗體反應。下同。A1～B3 200×；C1～F3 100×Immunofluorescence staining for SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，OCT4，SOX2 and NANOG in ICM colonies.A1-F1，A2-F2 and A3-F3.Light micrograph images，nuclear staining by Hoechst33342 and specific staining reactions，respectively.The same as below.A1-B3 200×；C1-F3 100×圖3 第1代牛ICM克隆多能性標記的表達Fig.3 Expression of pluripotency markers in ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 1

圖4 第10代牛ICM克隆多能性標記的表達 200×Fig.4 Expression of pluripotency markers in ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 10 200×

3.2SOX2、OCT4和NANOG在ICM和TE上的表達差異

a，b.P<0.05；A，B.P<0.01圖5 qRT-PCR檢測3個基因在ICM和TE上的表達差異Fig.5 Differences between inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) in expression of 3 target genes as determined by qRT-PCR

由于目前在牛上關于SSEA1、SSEA4和TRA-1-60 mRNA信息較少，所以本試驗沒有對其在ICM和TE上的表達進行qRT-PCR驗證。本試驗采用免疫磁珠法分離獲得高純度的ICM 和TE細胞，并通過qRT-PCR來進一步驗證OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表達。結果顯示這3個基因在ICM和TE中的表達存在差異，其中SOX2的差異極顯著，這表明SOX2最有可能成為牛ICM克隆的候選多能性標記。M.D.Goissi等[29]研究發現，SOX2在牛囊胚ICM中特異表達，并且SOX2表達量下降會導致附植前胚胎發育遲緩，這也表明SOX2有利于維持牛類ES細胞的多能性。而 H.Nagatomo等[16]用 Microarray的方法來篩選牛囊胚ICM和TE中的差異表達基因，結果顯示SOX2在ICM中表達量顯著上調；同時qRT-PCR 驗證OCT4和NANOG在ICM和TE中的表達情況，結果NANOG在ICM中的表達量顯著高于在TE中的表達量，而OCT4在二者中的表達量沒有區別；此研究表明，SOX2在牛囊胚ICM中的作用與其在小鼠囊胚中相似，它極有可能是牛囊胚ICM中的特異多能性標記基因。

H.Sumer等[30]研究發現，僅用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC不足以將牛成纖維細胞誘導為多能性細胞，而NANOG作為一個調節多能性的關鍵因子，在這個過程中起著至關重要的作用。此外，G.Gong等[24]利用RT-PCR檢測其所建立的牛類ES細胞系中多能性基因的表達情況，結果顯示NANOG和OCT4均有表達。V.Verma等[21]建立了牛類ES細胞系，經RT-PCR和qRT-PCR檢測顯示NANOG在此類ES細胞中表達。這些研究結果表明，NANOG也可能與維持牛類ES細胞多能性相關。OCT4在小鼠和人ES細胞中特異表達，但是由于物種間存在差異，目前很多研究中所建立的牛類 ES 細胞系都不表達OCT4[17，31-32]。D.Harris等[33]在牛附植前胚胎培養液中添加了 2i(CHIR99021 和 PD0325901)，然后利用免疫手術法分離獲得牛囊胚 ICM 并接種，并用 RT-PCR 檢測幾個與多能性相關的特異基因在其形成的克隆中的表達情況，結果表明，添加 2i顯著提高了SOX2和NANOG在ICM克隆中的表達水平，而對OCT4表達水平的影響不大。H.Nagatomo等[16]通過Microarray和qRT-PCR 檢測也發現OCT4在牛囊胚 ICM與TE中的表達量沒有明顯差異。而 D.K.Berg等[34]研究發現，與小鼠不同，在牛囊胚早期發育階段，OCT4不只在ICM中特異表達，在TE中也有表達。由此可見，OCT4 對于牛類 ES 細胞的作用還有待進一步研究。

綜上所述，免疫熒光染色試驗表明，在第10代牛囊胚ICM克隆上，表面標記蛋白(SSEA1、SSEA4和TRA-1-60)以及多能性基因(OCT4、SOX2 和NANOG)均表達，而qRT-PCR結果表明，SOX2在ICM與TE上的表達差異極顯著。本研究結果為早日確定牛類ES細胞的多能性分子標記及揭示其多能性調控網絡提供參考，進而有助于加速牛ES細胞系的成功建立。

[1] KIM E Y，NOH E J，PARK H Y，et al.Establishment of bovine embryonic stem cell lines using a minimized feeder cell drop[J].CellReprogram，2012，14(6)：520-529.

[2] RATHJEN J，LAKE J A，BETTESS M D，et al.Formation of a primitive ectoderm like cell population，EPL cells，from ES cells in response to biologically derived factors[J].JCellSci，1999，112(Pt5)：601-612.[3] EVANS M J，KAUFMAN M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature，1981，292(5819)：154-156.

[4] THOMSON J A，KALISHMAN J，GOLOS T G，et al.Isolation of a primate embryonic stem-cell line[J].ProcNatlAcadSciUSA，1995，92(17)：7844-7848.

[5] THOMSON J A，ITSKOVITZ-ELDOR J，SHAPIRO S S，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science，1998，282(5391)：1145-1147.[6] LI P，TONG C，MEHRIAN-SHAI R，et al.Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts[J].Cell，2008，135(7)：1299-1310.

[7] STICE S L，STRELCHENKO N S，KEEFER C L，et al.Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer[J].BiolReprod，1996，54(1)：100-110.

[8] CIBELLI J B，STICE S L，GOLUEKE P J，et al.Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells[J].NatBiotechnol，1998，16(7)：642-646.

[9] IWASAKI S，CAMPBELL K H，GALLI C，et al.Production of live calves derived from embryonic stem-like cells aggregated with tetraploid embryos[J].BiolReprod，2000，62(2)：470-475.

[10] MITALIPOVA M，BEYHAN Z，FIRST N L.Pluripotency of bovine embryonic cell line derived from precompacting embryos[J].Cloning，2001，3(2)：59-67.[11] SAITO S，SAWAI K，UGAI H，et al.Generation of cloned calves and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells[J].BiochemBiophysResCommun，2003，309(1)：104-113.

[12] WANG L，DUAN E，SUNG L Y，et al.Generation and characterization of pluripotent stem cells from cloned bovine embryos[J].BiolReprod，2005，73(1)：149-155.

[13] CAO S，WANG F，CHEN Z，et al.Isolation and culture of primary bovine embryonic stem cell colonies by a novel method[J].JExpZoolAEcolGenetPhysiol，2009，311(5)：368-376.

[14] FURUSAWA T，OHKOSHI K，KIMURA K，et al.Characteristics of bovine inner cell mass-derived cell lines and their fate in chimeric conceptuses[J].BiolReprod，2013，89(2)：28.

[15] CONG S，CAO G，LIU D.Effects of different feeder layers on culture of bovine embryonic stem cell-like cellsinvitro[J].Cytotechnology，2014，66(6)：995-1005.[16] NAGATOMO H，KAGAWA S，KISHI Y，et al.Transcriptional wiring for establishing cell lineage specification at the blastocyst stage in cattle[J].BiolReprod，2013，88(6)：158.

[18] LA BLOMBERG，BPVL TELUGU.Twenty years of embryonic stem cell research in farm animals[J].ReprodDomAnim，2012，47(Suppl4)：80-85.

[19] OZAWA M，HANSEN P J.A novel method for purification of inner cell mass and trophectoderm cells from blastocysts using magnetic activated cell sorting[J].FertilSteril，2011，95(2)：799-802.

[20] OZAWA M，SAKATANI M，HANKOWSKI K E，et al.Importance of culture conditions during the morula-to-blastocyst period on capacity of inner cell-mass cells of bovine blastocysts for establishment of self-renewing pluripotent cells[J].Theriogenology，2012，78(6)：1243-1251.

[21] VERMA V，HUANG B，KALLINGGAPPA P K，et al.Dual kinase inhibition promotes pluripotency in finite bovine embryonic cell lines[J].StemCellsDev，2013，22(11)：1028-1042.

[22] BRACKETT B G，OLIPHANT G.Capacitation of rabbit spermatozoainvitro[J].BiolReprod，1975，12(2)：260-274.

[23] ROSENKRANS C F，JR FIRST N L.Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotesinvitro[J].JAnimSci，1994，72(2)：434-437.

[24] GONG G，ROACH M L，JIANG L，et al.Culture conditions and enzymatic passaging of bovine ESC-like cells[J].CellReprogram，2010，12(2)：151-160.

[25] BUEHR M，MEEK S，BLAIR K，et al.Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts[J].Cell，2008，135(7)：1287-1298.

[26] SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative C (T) method[J].NatProtoc，2008，3(6)：1101-1108.

[27] GOOI H C，FEIZI T，KAPADIA A，et al.Stage-specific embryonic antigen involves alpha 1 goes to 3 fucosylated type 2 blood group chains[J].Nature，1981，292(5819)：156-158.

[28] ANDREWS P W，DAMJANOV I，SIMON D，et al.Pluripotency embryonal carcinoma clones derived from human teratocarcinoma cell line Tera-2：differentiationinvivoandinvitro[J].LabInvest，1984，50(2)：147-162.

[29] GOISSIS M D，CIBELLI J B.Functional characterization of SOX2 in bovine preimplantation embryos[J].BiolReprod，2014，90(2)：30.

[30] SUMER H，LIU J，MALAVER-ORTEGA L F，et al.NANOG is a key factor for induction of pluripotency in bovine adult fibroblasts[J].JAnimSci，2011，89(9)：2708-2716.

[31] YINDEE K J S，JIANG G，KANOK P，et al.Establishment and long-term maintenance of bovine embryonic stem cell lines using mouse and bovine mixed feeder cells and their survival after cryopreservation[J].ScienceAsia，2000，26：81-86.

[32] VRANA K E，HIPP J D，GOSS A M，et al.Nonhuman primate parthenogenetic stem cells[J].ProcNatlAcadSciUSA，2003，100(suppl 1)：11911-11916.

[33] HARRIS D，HUANG B，OBACK B.Inhibition of MAP2K and GSK3 signaling promotes bovine blastocyst development and epiblast-associated expression of pluripotency factors[J].BiolReprod，2013，88(3)：74.[34] BERG D K，SMITH C S，PEARTON D J，et al.Trophectoderm lineage determination in cattle[J].DevCell，2011，20(2)：244-255.

(編輯 程金華)

The Research of Pluripotency-related Marker Genes and Surface Markers in Bovine ICM Colonies

CUI Li-sha1，2，ZHAO Xue-ming2，HAO Hai-sheng2，DU Wei-hua2，MA You-ji1，ZHU Hua-bin2*，WANG Zong-li1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgricuturalSciences，Beijing100193，China)

This study was designed to investigate the pluripotency-related markers of bovine ES cells so as to provide a basis for optimizing culture conditions of bovine ES cells and promoting its research progress.The inner cell mass (ICM) were separated from bovine IVF blastocysts，seeded on mouse embryonic fibroblasts cultured in 2i/LIF medium and then passaged mechanically.The pluripotent markers of the ICM-derived colonies were detected at passage 1 and passage 10 by immunostaining.Additionally，the ICM and trophectoderm (TE) isolated from bovine blastocysts by magnetic activated cell sorting were used for qRT-PCR to validate the differences in gene expression between ICM and TE.We have derived ICM colonies from bovine IVF blastocysts and cultured them to passage 10，which displayed typical stem cell morphology and expressed specific markers such as OCT4，SOX2，NANOG，SSEA1，SSEA4 and TRA-1-60.Moreover，the results of qRT-PCR showed thatOCT4，SOX2 andNANOGwere differentially expressed between ICM and TE，SOX2 showed the most significant difference.In conclusion，2i/LIF culture medium is helpful for the culture of the ICM-derived colonies from bovine IVF blastocysts，andSOX2 is more likely to be a candidate pluripotency-related marker gene of bovine ICM-derived colonies.

bovine；ICM；pluripotency-related marker；qRT-PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.009

2015-01-05

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所家畜胚胎工程與繁殖創新團隊(ASTIP-IAS06-2014)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2014ywf-yb-2)

崔莉莎(1989-)，女，山東菏澤人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面的研究，E-mail：cuilishaxz@163.com

*通信作者：朱化彬，博士，研究員，E-mail：zhuhuabin@caas.cn；王宗禮，博士，研究員，E-mail：Wangzongli@sina.com

S823.2

A

0366-6964(2015)07-1141-09