豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白1α(nsp1α)的N端鋅指結構是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需

王 超，史西保，王 麗，陳 靜，司朝朝，王愛萍，鄧瑞廣，張改平1，，3*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.河南省農業科學院 農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002；4.河南師范大學生命科學學院，新鄉453007；5.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009；6.鄭州大學生物工程系，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白1α(nsp1α)的N端鋅指結構是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需

王 超1，2，5，史西保2，4，王 麗2，陳 靜2，司朝朝2，王愛萍6，鄧瑞廣2，張改平1，2，3*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.河南省農業科學院 農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002；4.河南師范大學生命科學學院，新鄉453007；5.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009；6.鄭州大學生物工程系，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是嚴重危害養豬業的病毒性傳染病之一，其致病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特異性免疫反應，引起機體免疫抑制，造成持續性感染，從而給該病的防控帶來困難。NLRP3炎癥小體作為先天性免疫的重要組分在機體抗病毒中發揮重要作用。前期研究發現PRRSV能夠激活NLRP3炎癥小體，但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎癥小體的組分還未見報道。本研究首先在缺失內源性炎癥小體的HEK293T細胞中，共轉染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個真核表達質粒，建立NLRP3炎癥小體的體外研究模型。然后，在該炎癥小體模型細胞和豬肺泡巨噬細胞中，轉染PRRSV nsp1α的真核表達質粒，結果表明nsp1α能夠明顯拮抗炎癥小體的活化，而進一步的突變試驗表明缺失N端鋅指(ZF)結構或者突變ZF結構的nsp1α均不能抑制NLRP3炎癥小體活化。本研究不僅首次發現了拮抗NLRP3炎癥小體活化的PRRSV蛋白——nsp1α，而且發現nsp1α 的N端鋅指結構是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需。本研究進一步發現了PRRSV拮抗天然免疫的新機制，并為PRRSV的防控提供了潛在的分子靶點和理論指導。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；nsp1α；ZF結構域；NLRP3炎癥小體；IL-1β

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)為有嚢膜的單股正鏈RNA病毒，與馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)、小鼠乳酸脫氫酶病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus，SHFV)同屬尼多病毒目動脈炎病毒科[1]。1991年歐洲首先分離到PRRSV，隨后美國、加拿大及中國等國家和地區也相繼分離到該病毒，PRRSV抑制宿主的天然免疫和特異性免疫反應，引起機體免疫抑制，從而給控制該病帶來了困難，給全世界的養豬業造成嚴重的經濟損失[2]。

越來越多的研究表明NLRP3炎癥小體作為先天性免疫的重要組分在機體免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用。NLRP3炎癥小體是最近研究較廣泛的炎癥小體，是由支架蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應分子procaspase-1相互結合而形成，主要介導procaspase-1的活化和促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的分泌。在巨噬細胞和樹突狀細胞中，由NLRP3炎癥小體介導的IL-1β的表達和分泌至少需要兩個信號刺激，一是如內毒素(LPS)等病原相關分子模式被細胞模式識別受體識別，從而使機體上調表達IL-1β的前體mRNA，另一信號是如ATP和Nigericin等引起NLRP3招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18前體，產生成熟的IL-1β和IL-18[3-4]。

前期報道流感病毒(influenza A virus，IAV)、腺病毒(adenovirus)、仙臺病毒(Sendai virus，Sev)以及PRRSV等都可以激活NLRP3炎癥小體[5-8]，而IAV的缺陷小鼠試驗表明，NLRP3、ASC和Caspase-1缺陷的小鼠在IAV感染中其呼吸道炎癥明顯削弱且死亡率顯著提高[5，7，9-10]，提示NLRP3炎癥小體可能在抗病毒感染中起重要作用，而相應的，病毒也表達抑制NLRP3炎癥小體的組分從而拮抗NLRP3先天性免疫[11-12]，因此篩選抑制NLRP3炎癥小體的病毒組分將會為進一步的抗病毒治療提供潛在分子靶點和理論基礎。因此，作者擬以PRRSV為研究對象，篩選可能抑制NLRP3炎癥小體活化的病毒組分，為進一步探討NLRP3炎癥小體在PRRSV免疫學中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株和菌株

PRRSV美洲型經典毒株BJ-4株(GenBank：AF331831)由中國農業大學楊漢春教授惠贈，本實驗室保存；MARC-145細胞和HEK293T細胞由本實驗室保存；E.coliDH5α感受態細胞購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PRMI-1640細胞培養基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶和反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司；TRIzol試劑購自Life Technologies公司；DNA回收試劑盒以及質粒抽提和純化試劑盒購自AxyGen公司；轉染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司；LPS(O55：B5)購自Sigma公司；Nigericin購自InvivoGen公司；豬IL-1β ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems公司。

1.3 質粒

pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C8A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C10A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C25A和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C28A均由本實驗室前期構建[13]。用LPS刺激PAMs，提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，分別用NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的特異性引物進行PCR，并將PCR產物克隆到真核表達載體pcDNA3.1-FLAG中，得到pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1和pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β。并由生工生物工程公司測序確證。PCR引物如下(表1)。

表 1 構建重組質粒所使用的引物及其序列

Table 1 Primers used in plasmid construction

引物Primers引物序列(5′?3′)SequencesNLRP3ForGATATCCATGAGCATGGCAAGCGTCCGCTNLRP3RevCTCGAGCTACTGGGAAGGCTCAAAGACAATprocaspase?1ForGGTACCCATGGCCGATAAGGTGCTGAAGGAprocaspase?1RevCTCGAGTTAATGTCCTGGGAAGAGATAApro?IL?1βForAAGCTTCATGGCCATAGTACCTGAACCCGCpro?IL?1βRevCTCGAGTTAGGGAGAGAGGACTTCCATGGTASCForAAGCTTCATGGGGTGCACGCGTGACGCCATASCRevCTCGAGTCAGCTCTGCTCCAGGTCGGCCACpro?IL?1βRTForCTTGAAGAGAGAAGTGGTGTTCTGpro?IL?1βRTRevATCACACAAGACAGGTACAGATTCT

1.4 豬肺泡巨噬細胞(PAMs)的制備

挑選6周齡左右，健康且PRRSV抗原抗體雙陰性豬。臂動脈叢放血致死，剖開胸腔，將氣管上下兩端結扎后，取出肺，用無菌PBS充分漂洗肺表面，然后，沿氣管內壁注入約100 mL含雙抗的無菌PBS緩沖液，輕輕拍打肺表面1～2 min，回收灌洗液，重復該步驟2～3次，直至灌洗液變清亮為止；將灌洗液用移液管輕輕吹打并用單層無菌濾網過濾，將收集到的灌洗液按照1 000 r·min-1離心8 min，用20 mL PBS重懸沉淀，重復2次，棄上清；用含雙抗的10%胎牛血清的RPMI-1640培養基重懸細胞，調節細胞濃度至1×106·mL-1，接種到24孔培養板中，37 ℃，5% CO2培養箱中培養6 h后，棄上清，更換培養基繼續培養。

1.5 炎癥小體模型重構

將HEK293T細胞用含10% FBS的DMEM培養基調至細胞濃度3.5×105·mL-1，按每孔500 μL鋪于24孔板中，待細胞密度達80%～90%時，用Lipofectamine 2000轉染pcDNA3.1-FLAG-NLRP3(150 ng)、pcDNA3.1-FLAG-ASC(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β(300 ng)和對照質粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)或pcDNA3.1-FLAG-nsp1α(600 ng)及其突變體至HEK293T細胞，具體操作嚴格按Lipofectamine 2000說明書進行。24 h后收集細胞上清液并用ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。

1.6 PAMs的質粒轉染

參照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α按照800 ng·孔-1，每組三個重復，對24孔板中新鮮制備的PAMs進行瞬時轉染，6 h后換液并用LPS(1 μg·mL-1)進行刺激，48 h后TRIzol裂解細胞，并用qRT-PCR檢測細胞中IL-1β mRNA的轉錄水平。

參照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α按照800 ng·孔-1，每組三個重復，對24孔板中新鮮制備的PAMs進行瞬時轉染，6 h后換液并用LPS(1 μg·mL-1)進行刺激，24 h后再加入Nigericin(10 μmol·L-1)共同刺激，48 h后收集細胞上清液并用ELISA試劑盒檢測IL-1β蛋白的表達水平。

1.7 RNA提取及Real-Time PCR

TRIzol試劑裂解PAMs，根據說明書提取總RNA，取1 μg RNA，按照PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄；然后以此cDNA為模板根據SYBR Green real-time PCR Master Mix說明書進行Real-Time PCR反應檢測IL-1β mRNA的轉錄水平。采用2-ΔΔCT方法進行基因相對表達分析，GAPDH為內參。所用跨內含子引物見表1。

1.8 IL-1β蛋白水平檢測

細胞上清液中IL-1β分泌水平的檢測采用商業化的豬IL-1β ELISA檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。

1.9 數據處理及分析

數據統計分析采用T檢驗法或單因素方差分析，當P<0.05時，數據之間具有顯著性差異，用“*”表示。本文所有圖表均使用GraphPad Prism 6.0軟件完成。

2 結 果

2.1 真核表達質粒構建

通過RT-PCR的方法從LPS刺激過的PAMs中克隆出NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β基因的編碼區序列，酶切后將其連接至pcDNA3.1-FLAG載體中，測序確證得到NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β基因的真核表達質粒pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1和pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β。

2.2 NLRP3炎癥小體模型重構

將pcDNA3.1-FLAG-NLRP3(150 ng)、pcDNA3.1-FLAG-ASC(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β(300 ng)和對照質粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)共轉染HEK293T細胞，24 h后收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。結果顯示(圖1)，在共轉染這四個炎癥小體相關質粒時，可以引起IL-1β的表達且表達量最高，而陰性對照組(只轉染對照質粒和只轉染pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β)的IL-1β的表達量則較低。結果表明在HEK293T細胞上成功重構了NLRP3炎癥小體模型。

HEK293T細胞轉染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β表達質粒或對照質粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測IL-1β蛋白表達HEK293T cells were transfected with expression plasmids encoding NLRP3，ASC，procaspase-1，and pro-IL-1β or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β expression was analysed by ELISA圖1 HEK293T細胞上重構NLRP3炎癥小體Fig.1 Reconstruct NLRP3 inflammasome in HEK293T cells

2.3 PRRSV nsp1α抑制由NLRP3介導的炎癥小體活化

PRRSV至少編碼16個非結構蛋白(nonstructural proteins，nsps)，這些nsps主要參與病毒基因組的復制和轉錄[14]。而研究表明PRRSV nsp1α是PRRSV的重要免疫抑制蛋白，具有抑制IFN-β轉錄和TNF-α的產生等作用[13，15-16]。因此，本試驗將探究nsp1α是否抑制NLRP3炎癥小體活化。將NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個炎癥小體相關質粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α(600 ng)或者對照質粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)共轉染HEK293T細胞，24 h后收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。結果顯示(圖2A)，共轉染nsp1α后，IL-1β的表達與共轉染對照質粒組相比，下降約50%，具有顯著性差異(P<0.05)。

另外，將nsp1α或對照質粒轉染PAMs并用LPS或LPS和Nigericin刺激后，qRT-PCR結果顯示(圖2B)，IL-1β的mRNA水平與對照質粒組相比，下降約60%，具有顯著性差異(P<0.05)；ELISA結果顯示(圖2C)，IL-1β蛋白水平的表達與對照質粒組相比，下降約24%，具有顯著性差異(P<0.05)。以上結果表明，PRRSV nsp1α可以抑制由NLRP3炎癥小體介導的IL-1β的表達。

A.HEK293T細胞轉染NLRP3炎癥小體相關質粒和nsp1α或對照質粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測IL-1β表達；B.PAMs轉染nsp1α或對照質粒pcDNA3.1-FLAG，LPS刺激后，qRT-PCR 檢測IL-1β mRNA表達；C.PAMs轉染nsp1α或對照質粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測IL-1β蛋白表達。*.P<0.05A.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.PAMs were transfected with nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS，IL-1β mRNA was quantified by qRT-PCR；C.PAMs were transfected with nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖2 PRRSV nsp1α可以抑制NLRP3炎癥小體活化介導的IL-1β產生Fig.2 PRRSV nsp1α can inhibit NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β production

2.4 nsp1α的N端ZF結構是其抑制NLRP3炎癥小體活化所必需的

nsp1α包含三個結構域：分別是N端的鋅指結構功能域(zinc-finger domain，ZF，Met1-Glu65)、中間的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶區域(papain-like cysteine protease，PCPα，Pro66-Gln166)和C端的延長區域(C terminal extension，CTE，Arg167-Met180)[17]。為研究nsp1α的ZF結構域是否在nsp1α抑制IL-1β的表達中發揮重要作用，將缺失ZF結構域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF或者只含有ZF結構域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF與炎癥小體相關質粒共轉染HEK293T細胞，24 h后收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。結果顯示(圖3A)，轉染缺失ZF結構域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF后，IL-1β的表達量與對照質粒組相比無顯著性差異，表明缺失ZF結構域后nsp1α不能夠抑制IL-1β的表達。另外，轉染只含有ZF結構域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF后，IL-1β的表達量與對照質粒組相比無顯著性差異。以上結果表明ZF結構域在nsp1α抑制IL-1β表達中起著不可或缺的作用。

在ZF結構域中，圍繞著Zn離子周圍與Zn離子結合的有四個半胱氨酸殘基(Cys8、Cys10、Cys25和Cys28)，而突變任何一個半胱氨酸殘基都會破壞ZF結構[15]。因此，將這四個單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、 nsp1α C25A、nsp1α C28A分別與炎癥小體相關質粒共轉染HEK293T細胞，24 h后收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。結果顯示(圖3B)，轉染四個突變體后，IL-1β的表達與對照質粒組無顯著性差異，表明突變任何一個半胱氨酸殘基后，nsp1α都不能夠抑制IL-1β的表達。

2.5 PRRSV nsp1α ZF結構域突變體轉染PAMs

按照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其ZF結構域突變體轉染PAMs，在LPS和Nigericin的共同刺激下，轉染48 h后收集細胞上清液，ELISA試劑盒檢測IL-1β的表達量。結果顯示(圖4)，轉染nsp1α后，IL-1β的表達與對照組相比，下降約30%，具有顯著性差異(P<0.05)，表明轉染nsp1α能夠抑制IL-1β的表達。而轉染PRRSV nsp1α ZF結構域的突變體后，與對照組相比，IL-1β的表達并無顯著性差異，均不能夠抑制IL-1β的表達。上述結果表明，在PAMs上，PRRSV nsp1α可以抑制由LPS和Nigericin引起的IL-1β的表達，并且ZF結構域在nsp1α抑制IL-1β表達的過程中是必需的。

A.HEK293T細胞轉染NLRP3炎癥小體相關質粒和nsp1α或缺失ZF結構域突變體nsp1α DZF或只含有ZF結構域突變體nsp1α ZF或對照質粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測IL-1β表達；B.HEK293T細胞轉染NLRP3炎癥小體相關質粒和nsp1α或四個單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、nsp1α C25A、nsp1α C28A或對照質粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測IL-1β表達。*.P<0.05A.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or nsp1α DZF or nsp1α ZF or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or nsp1α C8A，nsp1α C10A，nsp1α C25A，nsp1α C28A or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖3 HEK293T細胞上ELISA檢測結果Fig.3 The ELISA result in HEK293T cells

A.PAMs轉染nsp1α或缺失ZF結構域突變體nsp1α DZF或對照質粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測IL-1β表達；B.PAMs轉染nsp1α或四個單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、 nsp1α C25A、nsp1α C28A或只含有ZF結構域突變體nsp1α ZF或對照質粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測IL-1β表達。*.P<0.05A.PAMs were transfected with nsp1α or nsp1α DZF or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.PAMs were transfected with nsp1α or nsp1α C8A，nsp1α C10A，nsp1α C25A，nsp1α C28A or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖4 PAMs上ELISA檢測結果Fig.4 The ELISA result in PAMs

3 討 論

PRRS是影響世界養豬產業最為嚴重的疾病之一，每年給全世界養豬產業帶來巨大的經濟損失。PRRSV在感染豬體內主要侵害豬的巨噬細胞系統，特別是肺泡巨噬細胞，使受感染豬的免疫力降低，引發免疫抑制，造成持續性感染，從而給該病的預防和控制帶來了困難。越來越多的研究證明了NLRP3炎癥小體在宿主抗病毒感染中的重要作用。本研究首先利用HEK293T細胞缺失內源性炎癥小體的特點，通過共轉染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個真核表達質粒，在HEK293T細胞上建立了NLRP3炎癥小體的體外研究模型[12，18-19](圖1)。然后，利用該炎癥小體活化模型首次發現了拮抗炎癥小體活化的PRRSV蛋白-nsp1α(圖2A)。

IL-1β是一種重要的促炎性細胞因子，主要由單核細胞和巨噬細胞分泌，在宿主的先天性免疫系統和適應性免疫系統中發揮著重要作用。IL-1β的活性在其表達、成熟和分泌的過程中被嚴格調控，并且需要至少兩個信號的共同作用：第一信號是由促炎性刺激物如LPS引起的IL-1β前體(pro-IL-1β)的生成；第二信號是由如ATP和Nigericin等刺激引起的procaspase-1的活化，活化的caspase-1剪切pro-IL-1β，使其成熟并且釋放到細胞外。而圖2B和圖2C的結果不僅確證了圖2A 的結果，而且也暗示nsp1α不僅抑制炎癥小體活化的第一信號途徑，而且也抑制炎癥小體的第二信號途徑。

前期研究表明N端鋅指結構(C8-C10-C25-C28)在nsp1α抑制IFN-β中發揮著重要作用[13]，而本試驗的結果進一步證實ZF結構域在nsp1α抑制NLRP3炎癥小體介導的IL-1β的表達和分泌中發揮著不可或缺的作用(圖3和圖4)，這些試驗結果表明nsp1α的N端鋅指結構是其發揮免疫抑制功能的重要結構域。

綜上所述，PRRSV感染激活NLRP3炎癥小體并產生IL-1β等促炎性細胞因子來抵御病毒入侵和保護機體的同時，病毒自身又編碼能拮抗NLRP3炎性小體活化的蛋白——nsp1α，使自身能夠在宿主體內增殖。因此，本研究不僅進一步發現了PRRSV拮抗天然免疫的新機制——拮抗NLRP3炎性小體活化，而且也為PRRSV的防控提供了潛在的分子靶點和理論基礎。

4 結 論

在HEK293T細胞上成功重構NLRP3炎癥小體，利用這一模型以及LPS和Nigericin共刺激PAMs的模型，經過突變體轉染試驗共同證實了ZF結構在PRRSV nsp1α抑制由NLRP3炎癥小體信號通路介導的IL-1β表達的過程中是必需的。

[1] MEULENBERG J J，HULST M M，DE MEIJER E J，et al.Lelystad virus，the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS)，is related to LDV and EAV[J].Virology，1993，192(1)：62-72.

[2] NEUMANN E J，KLIEBENSTEIN J B，JOHNSON C D，et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].JAmVetMedAssoc，2005，227(3)：385-392.

[3] ATIANAND M K，RATHINAM V A，FITZGERALD K A.SnapShot：inflammasomes[J].Cell，2013，153(1)：272-272.e1.

[4] SCHRODER K，TSCHOPP J.The inflammasomes[J].Cell，2010，140(6)：821-832.

[5] THOMAS P G，DASH P，ALDRIDGE J R Jr，et al.The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1[J].Immunity，2009，30(4)：566-575.

[6] MURUVE D A，PéTRILLI V，ZAISS A K，et al.The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response[J].Nature，2008，452(7183)：103-107.

[7] KANNEGANTI T D，BODY-MALAPEL M，AMER A，et al.Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA[J].JBiolChem，2006，281(48)：36560-36568.

[8] BI J，SONG S，FANG L，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces IL-1β production depending on TLR4/MyD88 pathway and NLRP3 inflammasome in primary porcine alveolar macrophages[J].MediatorsInflamm，2014，2014：403515.

[9] ALLEN I C，SCULL M A，MOORE C B，et al.The NLRP3 inflammasome mediatesinvivoinnate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA[J].Immunity，2009，30(4)：556-565.

[10] ICHINOHE T，LEE H K，OGURA Y，et al.Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses[J].JExpMed，2009，206(1)：79-87.

[11] STASAKOVA J，FERKO B，KITTEL C，et al.Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase-1 activation in primary human macrophages，resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins 1beta and 18[J].JGenVirol，2005，86(Pt 1)：185-195.

[12] KOMUNE N，ICHINOHE T，ITO M，et al.Measles virus V protein inhibits NLRP3 inflammasome-mediated interleukin-1β secretion[J].JVirol，2011，85(24)：13019-13026.

[13] SHI X，ZHANG X，WANG F，et al.The zinc-finger domain was essential for porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein-1α to inhibit the production of interferon-β[J].JInterferonCytokineRes，2013，33(6)：328-334.

[14] SNIJDER E J，KIKKERT M，FANG Y.Arterivirus molecular biology and pathogenesis[J].JGenVirol，2013，94(Pt 10)：2141-2163.

[15] SONG C，KRELL P，YOO D.Nonstructural protein 1α subunit-based inhibition of NF-κB activation and suppression of interferon-β production by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology，2010，407(2)：268-280.

[16] SUBRAMANIAM S，BEURA L K，KWON B，et al.Amino acid residues in the non-structural protein 1 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus involved in down-regulation of TNF-α expressioninvitroand attenuationinvivo[J].Virology，2012，432(2)：241-249.

[17] SUN Y，XUE F，GUO Y，et al.Crystal structure of porcine reproductive and respiratory syndrome virus leader protease Nsp1alpha[J].JVirol，2009，83(21)：10931-10940.

[18] BRYAN N B，DORFLEUTNER A，ROJANASAKUL Y，et al.Activation of inflammasomes requires intracellular redistribution of the apoptotic speck-like protein containing a caspase recruitment domain[J].JImmunol，2009，182(5)：3173-3182.

[19] CHUANG Y T，LIN Y C，LIN K H，et al.Tumor suppressor death-associated protein kinase is required for full IL-1β production[J].Blood，2011，117(3)：960-970.

(編輯 白永平)

The Zinc-Finger Domain is Essential for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Nonstructural Protein 1α(nsp1α) to Inhibit the NLRP3 Inflammasome

WANG Chao1，2，5，SHI Xi-bao2，4，WANG Li2，CHEN Jing2，SI Chao-chao2，WANG Ai-ping6，DENG Rui-guang2，ZHANG Gai-ping1，2，3*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；4.CollegeofLifeSciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang453007，China；5.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China；6.DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) is an important viral infectious disease in swine industry worldwide.The causative agent is porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)，which can inhibit host innate and adaptive immune response，cause immunosuppression，and lead to persistent infection.So it is difficult to control and eradicate PRRS.As a critical part of innate immune，NLRP3 inflammasome plays an extremely important role in host anti-viral immunity.Previous studies have shown that PRRSV activated the NLRP3 inflammasome.However，whether there are components of PRRSV which suppress NLRP3 inflammasome remains unknown.Therefore，in the present study，we first reconstructed NLRP3 inflammasome through co-transfecting expression plasmids encoding NLRP3，ASC，procaspase-1，and pro-IL-1β in HEK293T cells which are deficient in endogenous inflammasomes.Then，HEK293T cells and porcine alveolar macrophages(PAMs) were transfected with expression plasmid encoding nsp1α of PRRSV.The results indicated that nsp1α can apparently block NLRP3 inflammasome activation.The further mutation experiments demonstrated that deletion or mutation of Zinc-Finger(ZF) domain in N-terminal of nsp1α fails to activate the NLRP3 inflammasome.Our study first demonstrated that nsp1α had the ability to suppress the NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β secretion and ZF domain was essential for nsp1α to inhibit the IL-1β induction.Our study reveals a new mechanism that PRRSV antagonize host innate immune responses and may provide some insights into the research on molecular targets of anti-PRRSV drugs and prevention of PRRS.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus；nsp1α；ZF domain；NLRP3 inflammasome；IL-1β

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.016

2015-05-11

國家自然科學基金青年基金(31302073)；國家自然基金重大基礎研究計劃 (31490600)；國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2014CB542700)；國家自然基金面上項目(31472177)

王 超(1985-)，男，河南鶴壁人，博士生，主要從事分子病原學和免疫學研究，E-mail:y-y-c@163.com

*通信作者：張改平(1960-)，男，河南內黃人，中國工程院院士，教授，博士，主要從事動物免疫學及疫病快速檢測技術研究，E-mail: zhanggaiping2003@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)11-2032-08