豬腎細胞源三種蛋白質對豬圓環病毒2型復制的調節作用

張 輝，唐青海，黃立平，危艷武，劉長明*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室，哈爾濱 150001；2.南陽師范學院 南陽市獸醫生物工程技術研究中心/昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，南陽 473061)

豬腎細胞源三種蛋白質對豬圓環病毒2型復制的調節作用

張 輝1，唐青海2*，黃立平1，危艷武1，劉長明1*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室，哈爾濱 150001；2.南陽師范學院 南陽市獸醫生物工程技術研究中心/昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，南陽 473061)

為了驗證豬腎細胞系(PK-15)源3種蛋白質基因(AP2α2、Elf4和ISCU)表達水平對豬圓環病毒2型(PCV2)復制的調節作用，采用RT-PCR擴增這3種蛋白質編碼基因，構建真核表達載體；同時設計這3種蛋白質的RNAi片段，分別插入到pGPU6-GFP載體構建shRNA干擾載體。以熒光定量PCR法檢測干擾效率，選取干擾效率較高的干擾載體，利用G418篩選轉染真核表達載體或干擾載體后的PK-15細胞。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)法檢測PCV2 LG毒株在這些細胞中的復制效率。結果表明，Elf4蛋白和ISCU蛋白基因過表達能夠顯著增強PCV2的復制；而AP2α2蛋白基因過表達對PCV2的復制無顯著影響。AP2α2、ISCU和Elf4這3種蛋白質基因被干擾表達后均可降低PCV2復制效率，表明這3種宿主細胞蛋白質對該病毒復制具有調節作用。

豬圓環病毒2型；復制；AP2α2；Elf4；ISCU

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是斷奶后多系統消耗綜合征(PMWS)、皮炎和腎炎綜合征的主要病原[1-4]。PCV2基因組是一個環狀的、長約1.7 kb單鏈DNA。病毒基因組包含2個主要開放閱讀框(ORFs)起始于兩個相反的方向，其中ORF1位于正鏈編碼兩個復制蛋白(Rep和Rep’)，對通過滾環復制機制進行復制的病毒是必須的[5-6]，而ORF2編碼衣殼蛋白(Cap)是病毒唯一的結構成分和主要免疫原[7-11]。由于病毒基因組小，編碼能力有限，因此病毒復制循環依賴于宿主細胞酶類；Rep和Cap蛋白可能不僅分別具有復制酶和病毒包裝的功能，在病毒與宿主之間相互作用機制中起重要作用。I.Tischer等[12]報道PCV復制具有細胞周期依賴性的，其DNA復制發生在細胞周期的S期。E.Steiner等[13]試驗表明PCV2復制效率和細胞自身的DNA復制無關。Q.Tang等[14]研究發現，PCV2的復制依賴于細胞周期S期和G2/M期，S期主要調節蛋白質Cyclin A的過表達能夠抑制PCV2的復制。S.Timmusk等[15]確定轉錄調節因子c-myc和中間絲蛋白(類似于人類的肌肉萎縮蛋白)與PCV2 Rep相互作用。這些數據說明，宿主分子參與了PCV2基因組的復制調節過程。

作者此前采用酵母單雜交技術從PK-15細胞cDNA文庫中篩選到一組與PCV2基因組頸環結構序列相互作用的宿主蛋白質[16]。在此基礎上，本試驗擬克隆其中3種蛋白質基因——豬配體相關的蛋白復合體α2亞基AP2α2(adaptor-related protein complex 2，alpha 2 subunit)、ETS相關的轉錄因子 Elf4(ETS-related transcription factor，Elf4)和鐵硫簇組裝酶ISCU(iron-sulfur cluster assembly enzyme，ISCU)基因，闡明這3種基因表達水平與PCV2復制效率之間的關系，為進一步研究PCV2的復制、致病性與宿主細胞蛋白質之間的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、質粒及主要試劑

豬腎細胞系(PK-15)用于PCV2增殖，細胞培養液為MEM營養液，含10%滅活胎牛血清，青、鏈霉素100 U(μg)·mL-1。PCV2 LG株、PCV2陽性、陰性血清和單克隆抗體(mAb)1D2為本實驗室保存。pEGFP-C1真核細胞表達載體購自Clontech(Mountain View，CA，USA)，大腸桿菌DH5α細胞購自天根生物技術(北京)有限公司。SYBR real-time PCR 試劑盒和PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 基因克隆與序列分析

采用Trizol法提取PK-15細胞的總RNA，取2 μg總RNA，采用Prime Script Ⅱ First Strand cDNA Synthesis Kit 合成第一鏈cDNA。取2 μL產物采用引物AP2α2 F1/R1[根據AP2α2基因序列(GenBank No.XR_242779.2)設計]、Elf4 F/R[根據豬的Elf4基因序列(GenBank No.XM_005673902.1)設計]和ISCU F1/R1[根據豬的ISCU基因序列(GenBank No.XM_005674454.1)設計]進行PCR擴增(表1)。PCR產物經純化后克隆至pMD18T載體，轉化DH5α感受態細胞進行抗性篩選，重組質粒進行酶切鑒定和序列測定。通過GenBank中的BLAST進行核酸序列比對分析。

1.3 重組真核表達質粒的構建

根據重組質粒pMD18T-AP2α2、pMD18T- Elf4和pMD18T-ISCU基因序列分別設計3對引物AP2α2-f1/r1、Elf4-f1/r1和ISCU-f1/r1(表1)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。利用AP2α2-f1/r1、Elf4-f1/r1和ISCU-f1/r1分別擴增AP2α2、Elf4和ISCU三個基因的開放閱讀框(ORF)。將PCR產物及pEGFP-C1質粒經SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后膠回收，T4連接酶連接后轉化DH5α感受態細胞，將AP2α2和ISCU基因分別克隆至pEGFP-C1載體；將PCR產物及pEGFP-C1經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切后膠回收，T4連接酶連接轉化DH5α感受態細胞，將Elf4基因克隆至pEGFP-C1載體，獲得重組真核表達質粒pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU。重組質粒經雙酶切和測序分析鑒定。

表1 PCR引物寡核苷酸序列設計及反應條件

Table 1 Oligonucleotide sequences of PCR primer and reaction conditions

引物名稱Name引物(5′?3′)Primer退火溫度/℃AnnealingtemperatureAP2α2?FCGGCCCAGAAAGCGGCGCTGGGACCCTGAG68AP2α2?RTAAAAATTGATCCCAAGATCCACCTTCTGCElf4?FATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGTGACCTGATCTTTGAGTTTG68Elf4?RTCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATGAGGGAAGTAGGGTISCU?FATGGCGTACTCCTCATCTCCATCGCTCTCACTCAC68ISCU?RTCATGTCTTCTCGGCCTCTCCTTTCTTGGGTTCTTAP2α2?f1ACGCGTCGACCCGGCCGTGTCCAAGGGGGACGGGAT68AP2α2?r1CGGGATCCCTAGGCGCCCTCTCGCCCCCGCCCCCACAGGCTElf4?f1ACGCGTCGACGCTATTACCCTGCAGCCCAGTGACCTGA64Elf4?r1TCCCCGCGGTCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATGAGGGAAGTAGGGISCU?f1ACGCGTCGACGCGGCGGCTGGCGCCGGCCGTCTAA68ISCU?r1CGGGATCCTCATGTCTTCTCGGCCTCTCCTTTCTTGGGTTCTTqAP2α2?F139GACAAGGCTCTGGACGGCT53qAP2α2?R275TGCTTCTCGGTGTATCTGqElf4?F888GGTGGTGATTGAAGACG56qElf4?R1146GACAAGCACGGTAGAGGTqISCU?F93GGCTCGGCTCTATCACAA53qISCU?R190CCAATCCGGTTCCAACATqACTB?F604CACGCCATCCTGCGTCTGGA62qACTB?R983AGCACCGTGTTGGCGTAGAG

引物AP2α2-f1、Elf4-f1和ISCU-f1下劃線序列均為SalⅠ酶切位點，AP2α2-r1和ISCU-r1下劃線序列為BamHⅠ酶切位點，Elf4-r1下劃線序列為SmaⅠ酶切位點

Primer sequences underlined for AP2α2-f1，Elf4-f1 and ISCU-f1 areSalⅠenzyme recognize sites，for AP2α2-r1 and ISCU-r1 areBamH Ⅰ enzyme recognize sites，for Elf4-r1 areSmaⅠ enzyme recognize sites

1.4 shRNA表達質粒的構建

為了抑制PK-15細胞中Elf4、AP2α2和ISCU內源基因的表達，根據AP2α2、Elf4和ISCU基因序列在蘇州基因制藥公司Co.，Ltd(蘇州)分別設計了3個shRNA表達質粒。將這3個基因片段(AP2α2-179-200、AP2α2-845-865、AP2α2-1511-1531、Elf4-47-67、Elf4-156-176、Elf4-906-927、ISCU-99-119和ISCU-292-312)分別克隆至pGPU6-GFP載體構建shRNA表達質粒pGPU6-GFP/AP2α2-179、pGPU6-GFP/AP2α2-845、pGPU6-GFP/AP2α2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-47、pGPU6-GFP/Elf4-156、pGPU6-GFP/Elf4-906、pGPU6-GFP/ISCU-292和pGPU6-GFP/ISCU-99，插入的序列見表2。

1.5 細胞轉染與穩定表達細胞系的建立

將處于指數生長期的PK-15細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到50%～60%時，更換新鮮的MEM 培養液，2 h后根據說明書將重組質粒通過轉染試劑TurboFect(Fermentas，Glen Burnie，MD，USA)轉染至PK-15細胞，將8 μL的轉染試劑加到4 μg溶解的DNA中輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入到細胞中。轉染48 h 后，以適當密度傳代(1∶8～1∶10比例)，并加入終質量濃度為1 500 μg·mL-1抗生素G418細胞培養液，連續培養。間隔2 d 更換含相同質量濃度的G418 細胞培養液1次，觀察細胞生長及死亡情況。同設未轉染的健康細胞為對照。待對照孔的細胞全部死亡后，將具有G418 抗性的陽性細胞持續在含有終濃度為800 μg·mL-1G418的培養液中傳代培養20 d。熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

表2 干擾表達質粒中的插入序列

Table 2 Inserted sequences in shRNA-expressing plasmids

載體名稱Plasmids插入序列(5′?3′)Inserts(5′?3′)pGPU6?GFP/AP2α2?179CACCGCAAGCTGCTCTTCATCTTCCTTCAAGAGAGGAAGATGAAGAGCAGC?TTGCTTTTTTGpGPU6?GFP/AP2α2?845CACCGCCTGGAGACGATTCTGAACATTCAAGAGATGTTCAGAATCGTCTCCA?GGCTTTTTTGpGPU6?GFP/AP2α2?1511CACCGGGAGTTTGGGAACTTGATAGTTCAAGAGACTATCAAGTTCCCAAACT?CCCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?47CACCGCAACGGGAATGGATGACATCCTTCAAGAGAGGATGTCAGTCCATTC?CGTTGCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?156CACCGCTGGACGATGTTCACAATGGTTCAAGAGACCATTGTTGAACATCGTC?CAGCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?906CACCGGACGAGAGAAGCGAAGTTACTTCAAGAGAGTAACTTCGCTTCTCTCG?TCCTTTTTTGpGPU6?GFP/shNCCACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAA?TTTTTTGpGPU6?GFP/ISCU?99CACCGCTCTATCACAAGAAGGTTGTTTCAAGAGAACAACCTTCTTGTGATAG?AGCTTTTTTGpGPU6?GFP/ISCU?292CACCGCAATTGCCTCCAGCTCATTATTCAAGAGATAATGAGCTGGAGGCAA?TTGCTTTTTTG

1.6 Western blot檢測

以真核表達載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU轉染PK-15細胞，經G418篩選后，取細胞經PBS洗3次；加入裂解液，200 μL·孔-1，37 ℃孵育15 min；將裂解產物12 000 g離心5 min；取上清樣品進行SDS-PAGE電泳后轉印硝酸纖維素膜上；用2%脫脂乳-PBS溶液封閉2 h；PBS-T(含0.05%Tween-20的0.01 mol·L-1PBS，pH7.2)洗膜3次，加入一抗(按1∶10 000比例用0.01 mol·L-1PBS稀釋的抗GFP標簽的單抗)，在搖床上孵育1 h；棄一抗用PBS-T洗膜3次； 加入二抗(按1∶5 000比例用0.01 mol·L-1PBS稀釋的DyLightTM羊抗鼠IgG)避光孵育1 h，用PBS-T洗膜3次；采用Odyssey Infrared Imaging System系統顯示結果。

1.7 總RNA提取與熒光定量PCR

收集瞬時轉染shRNA表達質粒的細胞，根據使用說明書采用TRIzol-苯酚-氯仿提取法分離總RNA。為了定量AP2α2、Elf4和ISCU的mRNA，使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將2 μg的總RNA反轉錄成單鏈cDNA。使用SYBR real-time PCR 試劑盒在熒光定量PCR系統上對cDNA進行熒光定量PCR，PCR程序：95 ℃ 10 s，52 ℃ 20 s，40個循環；95 ℃ 5 min。每個樣品通過與豬持家基因β-actin的閾值(Ct)的比值來標準化基因組含量。設計引物qAP2α2-F139/R275、qElf4-F888/R1146、qISCU-F93/R190和qACTB-F604/R983分別擴增AP2α2、Elf4、ISCU和β-actin，引物序列見表1。

1.8 過表達與抑制表達細胞系對病毒增殖影響測定

以構建的過表達細胞系pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和 pEGFP-ISCU，抑制表達細胞系 pGPU6-GFP/AP2α2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-906和pGPU6-GFP/ISCU-99及對照組pGPU6-GFP/shNC、pEGFP-C1細胞系和PK-15細胞分別與感染復數(moi)為1個TCID50/cell的PCV2 LG株，于37 ℃孵育96 h，細胞培養物反復凍融3次，離心去除細胞碎片，收集上清測定毒價。參考文獻[17]，用捕獲ELISA(一抗采用抗PCV2 Cap蛋白的1D2單抗)在405 nm波長下測定吸光光度值定量PCV2 LG的濃度；參考文獻[18]，在PK-15細胞中通過IPMA方法測定。

1.9 數據統計分析

試驗數據均采用SPSS11.5軟件進行平均值、標準差和差異顯著性計算分析，差異顯著水平為*，P<0.05，差異顯著水平為**，P<0.01。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增

以PK-15細胞cDNA為模板，用PCR擴增出這3種蛋白質基因產物(AP2α2、Elf4和ISCU)與預期大小2 601、1 989和919 bp相一致，如圖1顯示的特異性條帶，表明獲得了這3個蛋白質的編碼基因。

M.DNA相對分子質量標準；1．AP2α2基因；2．Elf4基因；3．ISCU 基因M.DNA marker；1．AP2α2 gene；2．Elf4 gene；3．ISCU gene圖1 AP2α2、Elf4和ISCU基因的RT-PCR擴增Fig.1 Amplification of AP2α2，Elf4 and ISCU genes by RT-PCR

2.2 重組真核表達載體的鑒定

重組載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU 雙酶切和凝膠電泳圖譜表明，從重組質粒中切下了與AP2α2、Elf4和ISCU序列長度一致的片段(圖2)，表明目的基因成功克隆至pEGFP載體。測序結果表明，克隆的AP2α2蛋白基因編碼的氨基酸序列與GenBank下載序列No.XM_003122395.3同源性比對顯示(圖3A)：第20位氨基酸異亮氨酸突變為蘇氨酸；68位氨基酸序列缺失谷氨酸；805位氨基酸后插入17個氨基酸序列。克隆的Elf4蛋白基因編碼的氨基酸序列與GenBank下載的序列No.XP_003135417.1同源性比對，僅發生3處單個氨基酸突變：213位氨基酸苯丙氨酸突變為絲氨酸；392位氨基酸蘇氨酸突變為異亮氨酸；603位組氨酸突變為精氨酸(圖3B)。克隆的ISCU蛋白基因序列與GenBank下載的No.XP_003359187.1完全一致(圖3C)。

M.DNA相對分子質量標準；1．重組載體pEGFP-AP2α2經Sal Ⅰ和BamHⅠ雙酶切；2．重組載體pEGFP-Elf4經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切；3．重組載體pEGFP-ISCU經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切M.DNA marker；1．Recombinant plasmid pEGFP-AP2α2 digested by SalⅠ and BamHⅠ；2．Recombinant plasmid pEGFP-Elf4 digested by SalⅠ and SmaⅠ；3．Recombinant plasmid pEGFP-ISCU digested by SalⅠ and SmaⅠ圖2 重組表達載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid of pEGFP-AP2α2，pEGFP-Elf4 and pEGFP-ISCU by enzymes digestion

2.3 AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質表達的Western blot檢測

將重組載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU轉染PK-15細胞，經G418篩選后得到穩定表達AP2α2、Elf4和ISCU 的細胞系。Western blot檢測表明，AP2α2、Elf4、ISCU和EGFP融合蛋白質的相對分子質量大小依次約為120、100和46 ku(圖4)。而EGFP大小約為30 ku，推斷豬AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質大小依次為90、70和16 ku。

2.4 shRNA干擾效果分析

采用熒光定量PCR檢測AP2α2、Elf4和ISCU的干擾效率，pGPU6-GFP/AP2α2-179、pGPU6-GFP/AP2α2-845和pGPU6-GFP/AP2α2-1511細胞中AP2α2 mRNA的相對轉錄量依次為1.0、0.7和0.5(圖5A)，其中pGPU6-GFP/AP2α2-1511的干擾效率為50%；pGPU6-GFP/Elf4-47、pGPU6-GFP/Elf4-156和pGPU6-GFP/Elf4-906細胞中Elf4 mRNA的相對轉錄量依次為0.23、1.0和0.15(圖5B)，其中pGPU6-GFP/Elf4-47和pGPU6-GFP/Elf4-906的干擾效率分別為77%和85%； pGPU6-GFP/ISCU-99和pGPU6-GFP/ISCU-292細胞中ISCUmRNA的相對轉錄量分別為0.30和0.39(圖5C)，二者的干擾效率分別為70%和61%。因此分別選取干擾效率較高的pGPU6-GFP/APα2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-906和pGPU6-GFP/ISCU-99 shRNA轉染PK-15細胞，經G418篩選后得到穩定抑制轉錄AP2α2、Elf4和ISCU的細胞系。

A～C.AP2α2、Elf4 和 ISCU推導蛋白質序列依次與GenBank參考序列比對A-C.Results of comparisons of amino acid sequence (AP2α2，Elf4 and ISCU ) with the reference sequences from GenBank，respectively圖3 AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質氨基酸序列比對Fig.3 Comparisons of amino acid sequence of AP2α2，Elf4 and ISCU

M．蛋白質相對分子質量標準； 1～3.融合蛋白EGFP-AP2α2、EGFP-Elf4和EGFP-ISCUM．Protein marker；1-3.EGFP-AP2α2，EGFP-Elf4 and EGFP-ISCU fusion proteins，respectively圖4 穩定細胞系中EGFP-EAP2α2、EGFP-Elf4和EGFP-ISCU融合蛋白質表達的Western blot鑒定Fig.4 Identification of fusion protein EGFP-AP2α2，EGFP-Elf4 and EGFP-ISCU expressed in stable cell lines by Western blot

2.5 三種蛋白質過表達對PCV2復制的影響

采用IPMA和ELISA方法檢測PCV2 LG毒株在不同細胞株中的增殖效率，如圖6所示，PCV2 LG的復制效率在轉染pEGFP-ISCU的細胞系中極顯著增強 (P<0.01)，轉染pEGFP-Elf4后的細胞系中也有顯著增加(P<0.05)。而相對于對照組PK-15和pEGFP-C1細胞系，AP2α2的過表達對PCV2 LG的復制沒有顯著影響。

2.6 三種蛋白質沉默表達對PCV2復制的影響

ELISA和IPMA檢測結果(圖7)均顯示，AP2α2和ISCU沉默表達均能極顯著地抑制PCV2 LG的增殖(P<0.01)；如圖7A所示，相對于對照組PK-15和pGPU6-GFP/shNC，抑制Elf4的表達并沒有影響PCV2 LG的復制水平，而IPMA測定結果顯示，PCV2 LG在上述干擾細胞中的復制效率均極顯著降低(P<0.01) (圖7B)。

A～C.AP2α2 mRNA、Elf4 mRNA和ISCU mRNA在不同shRNA干擾細胞系中的相對轉錄量A-C.AP-2α2 mRNA，Elf4 mRNA and ISCU mRNA levels in different shRNA expression cell lines圖5 shRNA干擾細胞系中mRNA的相對轉錄量Fig.5 Relative mRNA levels in different shRNA expression cell lines

A．捕獲ELISA方法測定PCV2 LG的含量；B．IPMA方法測定PCV2 LG毒價A．Detection of PCV2 LG by capture-ELISA； B．Titration of PCV2 LG by IPMA圖6 過表達AP2α2、Elf4或ISCU后對PCV2復制的影響Fig.6 The effect of AP2α2，Elf4 or ISCU overexpression on PCV2 propagation

A．ELISA方法測定PCV2 LG的含量；B．IPMA捕獲方法測定PCV2 LG的毒價A．Detection of PCV2 LG by capture-ELISA； B．Titration of PCV2 LG by IPMA圖7 AP2α2、Elf4或者ISCU沉默表達對PCV2復制的影響Fig.7 The influence of AP2α2，Elf4 or ISCU down-regulation by shRNA on PCV2 propagation efficiency

3 討 論

鑒于PCV2基因組小，編碼蛋白質能力有限，推測該病毒復制需要宿主細胞源酶類分子的參與，究竟哪些蛋白質參與其中尚不清楚。前期以酵母單雜交技術篩選出3種PK-15細胞源宿主蛋白質(AP2α2、ETS-4和ISCU)與PCV2基因組頸環結構序列相互作用。為進一步闡明這3種蛋白質基因表達水平對PCV2復制調節的作用，本研究從PK-15細胞中克隆AP2α2、Elf4和ISCU基因，構建針對AP2α2、Elf4和ISCU基因的過表達和抑制表達細胞系，旨在闡明這3種蛋白質編碼基因的表達水平與PCV2復制的相關性。

PCV2在過表達細胞系pEGFP-AP2α2和抑制表達細胞系pGPU6-GFP/AP2α2-1511中的增殖滴度檢測結果表明，AP2α2蛋白在PK-15細胞中過表達對PCV2復制影響不顯著；而采用shRNA降低細胞內源性AP2α2的表達量，干擾病毒復制效率達50%以上，極顯著地抑制了PCV2復制(P<0.01)。AP2蛋白復合體含有4個亞基(α2、β2、μ2和σ2)，其主要功能是作為配體將受體蛋白與網格蛋白連接，在細胞內物質轉運中起重要作用[19]。AP2α已被證明能夠負調節1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的復制效率，采用siRNA干擾AP2α的表達能夠顯著上調HIV的復制，這可能與該蛋白質妨礙了HIV基因組DNA正常進入細胞核有關[20]，且AP2α介導的HIV復制調控可能與未知的HIV-1基因組的DNA片段有關[21]。R.Chaudhuri等發現，HIV-1 Nef蛋白與AP2-網格蛋白互作加速CD4內吞，從而下調巨噬細胞和T細胞受體CD4的表達，這是激發HIV-1感染者轉變為AIDS的重要原因之一[22]。其過表達對PCV2的復制沒有影響，被干擾后反而有抑制作用。據此推測，該蛋白質可能與PCV2基因組的轉運相關，可能是AP2α2負責將PCV2基因組由細胞質轉運到細胞核。正常情況下，一定數量病毒感染細胞后，細胞內AP2α2足夠把溶酶體中脫去衣殼蛋白的PCV2裸露DNA運輸到細胞核中，一旦被RNAi之后，其運輸能力受限，導致PCV2復制被抑制。

PCV2在Elf4蛋白過表達細胞系中的復制顯著增強。反之，以shRNA沉默細胞內源性Elf4蛋白表達，干擾病毒復制效率達85%以上，表明PCV2的復制被顯著抑制。采用ELISA方法檢測結果表明，PCV2的復制沒有受到顯著影響。Elf4是一個轉錄激活因子，能夠起始多種基因的轉錄，該蛋白質還與自然殺傷細胞的形成和天然免疫功能有關[23]。最近研究發現，Elf4在Ⅰ型干擾素IFNα/β應答反應中起重要調節作用[24]，這對機體的抗病毒感染防御十分重要[25]。Rep蛋白是PCV2基因組復制的主要復制酶[6，26-27]，有報道表明，干擾PCV2和PCV1Rep基因后，病毒在PK-15細胞中的增殖能力顯著下降[28]。綜合本研究數據，作者推測Elf4蛋白功能有可能是通過促進PCV2 Rep蛋白的轉錄作用來提高PCV2復制效率。令人感興趣的是，鑒于ELISA測定值代表Cap蛋白含量，不是感染性的病毒粒子，推測Cap蛋白的轉錄與Elf4蛋白表達量無關。

PK-15細胞源ISCU蛋白過表達能夠顯著增強PCV2復制；而采用shRNA降低細胞內源性ISCU的表達量，干擾病毒復制效率達70%以上，表明其能夠極顯著地抑制PCV2復制。ISCU為鐵硫簇組裝酶，屬于一種金屬酶，它在電子傳遞、底物結合與激活等方面起關鍵作用，且參與基因表達的轉錄和翻譯調控[29-30]。T.Finsterbusch等研究證明有3種宿主細胞蛋白質(ZNF265、TDG和VG5Q)與Rep蛋白發生互作，這些蛋白質與病毒基因轉錄調節相關[31]。據此推測，ISCU蛋白可能直接調控PCV2基因的轉錄，亦可能通過催化、調節Rep蛋白的酶活性實現PCV2 復制的調控。

本研究闡明了PK-15細胞源AP2α2、Elf4和ISCU3個基因表達量對PCV2復制的調節作用，三者可能在PCV2復制過程中不同的關鍵環節以不同的方式進行調控，具體調節分子機制需要進一步研究。

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(編輯 白永平)

Regulation Effect of Three Proteins Derived from Porcine Kidney Cells on Porcine Circovirus Type 2 Replication

ZHANG Hui1，TANG Qing-hai2*， HUANG Li-ping1，WEI Yan-wu1，LIU Chang-ming1*

(1.DivisionofSwineInfectiousDiseases，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China；2.CenterforNanyangVeterinaryBiologicalEngineeringTechnology，HenanProvincialEngineeringLaboratoryofInsectBio-reactor，NanyangNormalUniversity，Nanyang473061，China)

To investigate the regulative effect of expression level of three proteins gene (AP2α2，Elf4 andISCU) derived from porcine kidney cell line (PK-15) on porcine circovirus type 2 (PCV2) propagation efficiency,the genes of three proteins were amplified by RT-PCR and then three eukaryotic expression vectors were constructed.The RNAi fragments of these proteins were designed and cloned into pGPU6-GFP vector to construct shRNA vectors respectively.The efficiency of interference was determined by real-time PCR and three shRNA expression plasmids with higher efficiency of interference were determined.The PK-15 cells transfected with eukaryotic expression vectors or shRNA were screened by antibiotics of G418.The propagation efficiency of strains PCV2 LG in the cell lines was investigated using a capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA).The results showed that Elf4 and ISCU overexpression increased PCV2 replication.In contrast，overexpression of AP2α2 exhibited no significant influence on PCV2 replication.In contrast，AP2α2，ISCU and Elf4 down-regulation by shRNA resulted in decreased PCV2 propagation，which demonstrated that these three proteins play a regulative role in PCV2 replication.

porcine circovirus type 2； replication；AP2α2；Elf4；ISCU

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.017

2014-12-19

國家自然基金青年基金(31101837)

張 輝(1987-)，女，山東泰安人，博士生，主要從事動物病毒學研究

*通信作者：唐青海，E-mail：qinghaitang109@126.com；劉長明，E-mail：lcm@hvri.ac.cn，Fax:0451-82733132

S852.659.2

A

0366-6964(2015)11-2040-10