副豬嗜血桿菌lgtF基因缺失株的構建及其部分生物學特性

曾 澤，何 歡，岳 華，湯 承，張 斌

(西南民族大學 生命科學與技術學院，成都 610041)

副豬嗜血桿菌lgtF基因缺失株的構建及其部分生物學特性

曾 澤，何 歡，岳 華，湯 承，張 斌*

(西南民族大學 生命科學與技術學院，成都 610041)

lgtF基因編碼的葡萄糖基轉移酶在脂寡糖(LOS)的合成過程中負責增加一個葡萄糖合成庚糖I，在部分革蘭陰性菌中是重要的毒力相關基因，但lgtF基因在副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)中的作用還不清楚。本研究利用遺傳操作方法構建HPS SC096的lgtF基因缺失株(ΔlgtF)。通過熱酚法分別提取缺失株與野生株的LOS，將提取的LOS進行SDS-PAGE和銀染。比較缺失株與野生株的生長曲線、抗血清中補體殺菌能力以及對宿主細胞——豬血管內皮細胞(PUVEC)和豬腎上皮細胞(PK-15)的黏附和入侵能力。結果表明與野生株相比，ΔlgtF的LOS糖鏈結構變短，生長速度稍微減慢，另外，ΔlgtF在兔和豬血清中抗補體殺菌能力明顯降低(P<0.05)，對PUVEC和PK-15細胞的黏附入侵能力明顯降低(P<0.05)。以上結果表明lgtF基因是HPS的一個毒力相關基因。

副豬嗜血桿菌；lgtF基因；缺失株；毒力相關基因

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS) 屬于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)，能引起豬的多發性漿膜炎、關節炎以及腦膜炎為主要特征的豬革拉澤病(Gl?ser’s disease)[1-2]。HPS感染豬群會引起較高的發病率和死亡率，對養豬業造成巨大的經濟損失[2]。HPS分為15個血清型，而且不同血清型間毒力有明顯差異[1，3]。研究發現LOS參與HPS對宿主細胞的黏附作用，并能促進炎性因子 IL-6 和IL-8的表達[4-5]，證實LOS參與了HPS致病過程，是一個重要的毒力因子。

LOS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，在發病機制中起著重要的作用[6-9]。LOS由脂質A、2-酮-3-脫氧辛酸、庚糖和其他糖基組成[10]。單糖分析顯示HPS的LOS含有葡萄糖、半乳糖、半乳糖-N等多種成分，其中葡萄糖是主要組成成分[11]，這為LOS功能的研究奠定了基礎。lgtF基因編碼的葡萄糖基轉移酶負責增加一個葡萄糖合成庚糖I，并參與LOS的合成[12-15]。研究表明在多數革蘭陰性菌中lgtF基因是重要的毒力基因[13-16]。但是，lgtF基因在HPS致病過程中的作用還不清楚。本試驗通過構建HPS SC096的ΔlgtF缺失株，并對其LOS結構、生長特性、抗血清殺菌能力以及對細胞的黏附和入侵能力進行研究，以確定lgtF基因在HPS致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒、細胞

副豬嗜血桿菌SC096分離株、質粒pK18mobsacB和pHV1249由華南農業大學廖明教授饋贈。質粒pMD-19T購自TaKaRa公司。PUVEC和PK-15細胞由本實驗室保存。

1.2 主要儀器和試劑

恒溫金屬浴購自博日公司；CO2培養箱購自Thermoforma公司；高速離心機5804購自Eppendorf 公司；普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀powerpac universalTM、凝膠成像系統VersaDoc2000購自Bio-Rad 公司。TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)購自青島海博試劑有限公司；新生牛血清購自鄭州佰安生物工程有限公司；NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)購自北京博奧拓達科技有限公司，DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco公司，卡那霉素、氨芐霉素、紅霉素均購自上海生工公司，pMD-19T載體、感受態DH5α，ExTaq、T4連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；Gel extraction kit試劑盒，Cycle-pure kit試劑盒和Plasmid Mini kit試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設計

根據NCBI(GenBank：CP001321.1)已發布的HPS SH0165中lgtF的序列，利用Primer Premier 5.0設計所用引物(表 1)，各引物均由上海生物工程公司合成。引物中下劃線部分為酶切位點。

1.4 缺失株的構建

用引物P1/P2 從HPS SC096菌株的基因組中擴增lgtF基因的上臂片段(481 bp)，用引物P3/P4 從SC096菌株的基因組中擴增lgtF基因的下臂片段(484 bp)。以上下臂片段為模板用引物P1/P4進行重疊序列延伸PCR，將lgtF基因上下臂連接起來，純化回收，克隆轉化到pMD19-T載體獲得質粒pZZ001。用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ對質粒pZZ001進行雙酶切，純化回收，克隆轉化到pK18mobsacB并獲得質粒pZZ002，將863 bp的紅霉素抗性片段轉入到質粒pZZ002獲得質粒pZZ003，用已優化過的自然轉化方法[17]將質粒pZZ003轉入HPS SC096株獲得lgtF基因缺失株。

表1 本研究所用的引物序列

Table 1 Sequences of primers used in this study

引物Primer引物序列(5′?3′)Sequence長度/bpLengthP1(lgtF?up?HindⅢ?F)P2(lgtF?up?BamHⅠ?SalⅠ?R)CCCAAGCTTACCGCTTGTGGTAATGAAGAACAGATTACGTCGACATGCTCGGATCCTCAACTGAAGGATTCTAC481P3(lgtF?down?BamHⅠ?SalⅠ?F)P4(lgtF?down?EcoRⅠ?F)GGATCCGAGCATGTCGACAGGTTATCCTTTTTGAAATTACGGAATTCACAAGCGGTCCCTATGAATATATCACTG484P5(EmRBamHⅠ?F)P6(EmRSalⅠ?R)CGCGGATCCTTTAGTATTTTTGTAATCAGACGTGTCGACTTACTTATTAAATAATTTATA863P7(lgtF?BamHⅠ?F)P8(lgtF?R)CGCGGATCCGCGCTTGATGCGGAGCATTCAACCTTACAGCCAACGATTAGCGTC1009

下劃線部分為酶切位點

Restriction sites are underlined

1.5 LOS提取與SDS-PAGE

采用熱酚法[18]分別提取HPS SC096株與ΔlgtF缺失株的LOS，將提取的LOS進行SDS-PAGE(5%濃縮膠，18%分離膠)并銀染[19]分析。

1.6 生長曲線的測定

將HPS SC096株與ΔlgtF缺失株接種于TSB液體培養基，37 ℃培養12 h左右作為種子液。再將上述種子液按培養基總體積的1% 接種于事先預熱到37 ℃的TSB液體培養基，于37 ℃，180 r·min-1振蕩培養，每個樣本設置3個平行。其間每隔1 h取樣進行平板菌落計數，用分光光度計測定培養基的OD600 nm值，并將結果繪制成曲線。

1.7 抗血清中補體殺菌試驗

根據已描述的抗血清殺菌實驗方法[15]，取100 μL新鮮的豬血清和兔血清或56 ℃滅活30 min的豬血清和兔血清，分別與100 μL 細菌(1×108CFU·mL-1)混合；取180 μL新鮮的豬血清和兔血清或56 ℃滅活30 min的豬血清和兔血清分別與20 μL 細菌(1×108CFU·mL-1)混合，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養1 h，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個樣本設置3個平行。細菌存活率即為在新鮮血清中存活的細菌除以在滅活血清中的存活率。

1.8 細胞黏附入侵試驗

為了確定細菌對細胞的黏附效果，參考文獻[20]方法將豬血管內皮細胞(PUVEC)和豬腎上皮細胞(PK-15)接到24孔細胞培養板，加入含10%的胎牛血清的DMEM培養基，5% CO237 ℃培養24 h。用107CFU的菌液感染細胞，37 ℃培養2 h，用PBS清洗細胞3次，用0.1 mL 0.25%胰酶37 ℃消化細胞10 min，再加入0.9 mL TSB將細胞取出，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個樣本設置3個平行。

為了確定細菌對細胞的入侵效果，參考文獻[20]將豬血管內皮細胞(PUVEC)和豬腎上皮細胞(PK-15)接到24孔細胞培養板，加入含10%的胎牛血清的DMEM培養基，5% CO237 ℃培養24 h。用107CFU的菌液感染細胞，37 ℃培養2 h，用PBS清洗細胞3次，加入含 20 μg·mL-1的慶大霉素的DMEM 37 ℃培養2 h，用PBS清洗細胞3次，用0.1 mL 0.25%胰酶37 ℃消化細胞10 min，再加入0.9 mL TSB將細胞取出，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個樣本設置3個平行。

1.9 數據統計

數據通過SPSS Statistics軟件進行獨立樣本t檢驗分析差異顯著性，P<0.05表明差異顯著。

2 結 果

2.1 缺失株ΔlgtF的構建與驗證

用質粒pZZ003與HPS SC096株進行自然轉化，用含Em的TSA平板(含血清和NAD)進行篩選，獲得Em抗性的接合子。用引物P5/P6和P7/P8檢測ΔlgtF缺失株(圖1A、1B)。當用引物P5/P6分別對野生型SC096株和ΔlgtF缺失株基因組進行擴增時，電泳圖1A顯示ΔlgtF缺失株能被擴增出一條750到1 000 bp之間條帶，與預期的863 bp的紅霉素抗性片段一致。當用引物P7/P8分別對野生型SC096株和ΔlgtF缺失株基因組進行擴增時，電泳圖1B顯示野生型SC096株能被擴增出一條大約1 000 bp條帶，與預期的1 009 bp的lgtF基因片段一致。從圖1C可以看出ΔlgtF缺失株是由紅霉素抗性片段取代野生型SC096株中lgtF基因目的片段而成。

2.2 野生株與缺失株ΔlgtF的LOS結構及生長特性的比較

為了比較HPS SC096株與ΔlgtF缺失株LOS的不同，將提取的野生株和ΔlgtF的LOS經SDS-PAGE并銀染后得到圖2A。銀染圖顯示ΔlgtF缺失株的LOS泳動明顯快于野生株LOS，這表明ΔlgtF缺失株LOS的相對分子質量有所減小，LOS的糖鏈結構有所縮短，即表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后LOS的糖鏈結構縮短。HPS SC096株與ΔlgtF缺失株的生長曲線圖(圖2B)顯示ΔlgtF缺失株的生長速度略低于野生株的生長速度。

2.3 野生株與ΔlgtF缺失株抗血清殺菌能力比較

為了研究HPS的lgtF基因是否參與了抗血清殺菌的作用，對野生型SC096株和ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力進行了比較。結果表明在50%和90%的血清中，野生型SC096株具有高水平的抵抗血清殺菌能力(圖3)。在50%和90%血清中，與野生型SC096株相比ΔlgtF缺失株細菌存活率大約降低了1.5和2倍(P<0.05)。這表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后抗血清殺菌能力明顯降低。

A.引物P5/P6鑒定；B.引物P7/P8鑒定； C.ΔlgtF缺失株和野生型SC096株模式圖；M.DNA相對分子質量標準；1.野生型SC096株；2.ΔlgtF缺失株；3.陰性對照A.Identification by primer P5 and P6；B.Identification by primer P7 and P8；C.Characterization and construction of ΔlgtF mutant and wild-type SC096；M.DL2000 DNA marker；1.Wild-type SC096；2.ΔlgtF mutant；3.Negative control圖1 ΔlgtF缺失株的鑒定Fig.1 Identification of ΔlgtF mutant strain

A.LOS的銀染圖；1.野生型SC096；2.ΔlgtF缺失株；B.生長曲線，誤差線代表三次重復試驗之間的標準誤A.LOS profiles；1.Wild-type SC096 strain；2.ΔlgtF mutant；B.Growth curve，error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖2 野生株與ΔlgtF缺失株的LOS SDS-PAGE銀染圖及生長曲線Fig.2 LOS profiles and growth curve of wild-type SC096 strain and ΔlgtF mutant

A.50%豬和兔血清；B.90%豬和兔血清；*.與野生型SC096株相比差異顯著(P<0.05)，誤差線代表三次重復試驗之間的標準誤A.50% porcine and rabbit sera；B.90% porcine and rabbit sera；*.Significant difference (P<0.05) between strains.Error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖3 野生型SC096株和ΔlgtF缺失株在豬和兔血清中抗血清殺菌作用Fig.3 Survival of wild-type SC096 strain and the ΔlgtF mutant in porcine and rabbit sera

2.4 野生株與ΔlgtF缺失株對細胞黏附入侵能力比較

為了研究lgtF基因在HPS對細胞黏附入侵中發揮的作用，對ΔlgtF缺失株和野生型SC096株的黏附、入侵水平進行了比較(圖4)。發現ΔlgtF缺失株對PK-15 和 PUVEC細胞的黏附水平明顯的降低(P<0.05)，相對于野生型SC096株，ΔlgtF缺失株的黏附量降低2倍。而且，ΔlgtF缺失株對PK-15 和 PUVEC細胞的入侵量也表現出明顯的降低(P<0.05)，相對于野生型SC096株，ΔlgtF缺失株的入侵水平大約降低2倍。這表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后對細胞的黏附入侵能力明顯降低。

*.與野生型SC096株相比差異顯著(P<0.05)，誤差線代表三次重復試驗之間的標準誤*.Significant difference (P<0.05) between strains.Error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖4 野生型SC096株和ΔlgtF缺失株對PK-15和PUVEC細胞的黏附和入侵Fig.4 Adherence(A) and invasion(B) of H.parasuis wild-type SC096 and ΔlgtF mutant in PK-15 and PUVEC cells

3 討 論

LOS除了可以保持外膜的穩定和保護細胞免受外界環境的壓力之外，通常作為內毒素、黏附因子、宿主防御因子等參與多數革蘭陰性菌的致病機制[21-23]。在HPS中，LOS已經被證實為重要的毒力因子[4-5，11，24]。為了進一步研究LOS成分與HPS發病機制之間的關系，本研究從HPS SC096基因組中敲除lgtF基因獲得ΔlgtF缺失株。而且該ΔlgtF缺失株的LOS糖鏈結構明顯變短，這表明在HPS中lgtF基因參與LOS的合成，這與之前的相關研究結果一致[13-15，25]。在HPS中，庚糖I已被證實參與LOS的合成[24]。推測由于缺失掉lgtF基因之后，菌體內缺乏葡萄糖基轉移酶從而影響庚糖I的合成，最終導致LOS糖鏈結構的變短。ΔlgtF缺失株的生長速度略低于野生株的生長速度，這表明lgtF基因參與HPS SC096的生長代謝，這可能是由于HPS SC096敲除掉lgtF基因后外膜不穩定而影響了菌株的生長代謝。

抗血清殺菌作用是病原菌一種重要的毒力機制[26]。引起全身性感染的HPS具有抵抗補體介導的血清殺菌作用，這個特性有助于細菌突破機體的防御系統而在血液中存活。在HPS 中，缺失掉rfaE、CDT、rfaF和opsX基因后都會使菌株的抗血清殺菌能力明顯地降低，表明rfaE、CDT、rfaF和opsX基因參與HPS的抗血清殺菌作用[20，24，27]。在流感嗜血桿菌和空腸彎曲桿菌中，缺失lgtF基因都會使菌株的抗血清殺菌能力明顯降低[13，15]。在本研究中，ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力與野生株相比明顯降低，推測可能是由于LOS結構的不完整性影響了菌株抵抗補體介導的血清殺菌作用。這表明在HPS SC096的抗血清殺菌作用中lgtF基因起著重要的作用，因此可以推測lgtF基因在HPS SC096的毒力中扮演著重要的角色，可能是一個毒力相關基因。

對宿主細胞的黏附和入侵是病原體發病機制中的關鍵步驟。在HPS 中，缺失掉rfaE、CDT、rfaD、rfaF和opsX基因后都會顯著降低菌株對細胞的黏附能力，這表明在HPS中rfaE、CDT、rfaD、rfaF和opsX都是重要的黏附因子[20，24，27-28]。在流感嗜血桿菌和空腸彎曲桿菌中，ΔlgtF缺失株在體內的定植能力和增殖能力都明顯下降[13，29]。在本研究中，缺失lgtF基因之后菌株對PK-15和PUVEC細胞的黏附和入侵能力都明顯降低，這可能是由于ΔlgtF缺失株的LOS結構不完整導致菌株的外膜結構不穩定引起的。這表明lgtF基因在HPS SC096對PK-15和PUVEC細胞的黏附和入侵過程中起重要作用，因此可以推測lgtF基因可能是HPS的黏附因子，但也可能是導致了其他黏附因子功能的下降或喪失。

4 結 論

成功構建HPS SC096的ΔlgtF缺失株。ΔlgtF缺失株的LOS糖鏈結構明顯變短，生長速度稍微減慢；ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力以及對宿主細胞的黏附和入侵能力都明顯降低。以上結果表明在HPS SC096致病過程中lgtF基因可能是一個重要的毒力相關基因。

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(編輯 白永平)

Construction and Characterization of aHaemophilusparasuisSC096 ΔlgtFMutant Strain

ZENG Ze，HE Huan，YUE Hua，TANG Cheng，ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

ThelgtFencodes a glucosyltransferase responsible for adding a glucose to get heptose I in the synthesis of Lipooligosaccharide (LOS).ThelgtFgene is an important virulence-associated gene in some Gram-negative bacteria.However，the function oflgtFgene inHaemophilusparasuiswas still unknown.We constructed an ΔlgtFmutant (ΔlgtF) ofH.parasuisSC096 using a natural transformation system.The LOS ofH.parasuisSC096 strain，ΔlgtFmutant was extracted by the hot phenol-water method.The LOS was addressed by SDS-PAGE and sliver stain.The growth curve，Serum resistance activity，adhesion and invasion ability in porcine kidney epithelial cells (PK-15) and porcine umbilical vein endothelial cells (PUVEC) of wild type SC096 and ΔlgtFmutant were measured.Compared to the wild-type SC096 strain，the ΔlgtFmutant exhibited obvious truncation of LOS structure and slight growth defect.Furthermore，the mutant had a greater sensitivity to the bactericidal action of porcine and rabbit serum (P<0.05)，and displayed a significantly reduced ability to adhere to and invade PK-15 and PUVEC (P<0.05).The above findings suggested that thelgtFgene is a virulence-associated gene of theH.parasuisSC096 strain.

Haemophilusparasuis；lgtFgene；mutant；virulence-associated gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.019

2015-03-04

國家自然科學基金(31302119)；四川省教育廳項目(14ZB046)；公益性行業(農業)科研專項(201303034-1)；西南民族大學中央高校基本科研業務費專項(2014NZYQN42)

曾 澤(1991-)，女，貴州畢節人，碩士生，主要從事動物病原分子生物學，E-mail:839017291@qq.com

*通信作者：張 斌，副研究員，E-mail：binovy@sina.com

S852.613

A

0366-6964(2015)11-2056-07