弓形蟲強免疫原性排泄分泌抗原組分的鑒定

葉 強，王 萌，張念章，殷 宏，2，張德林，2*

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

弓形蟲強免疫原性排泄分泌抗原組分的鑒定

葉 強1，王 萌1，張念章1，殷 宏1，2，張德林1，2*

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

旨在篩選弓形蟲排泄分泌抗原(ESA)中具有強抗原性的蛋白質組分。通過雙向電泳和免疫印跡技術，對弓形蟲ESA進行分析。結果共篩選到了18個免疫顯性蛋白質點，并成功對其中6個具有代表性的蛋白質點進行了質譜鑒定，顯示為微線體蛋白1、微線體蛋白4、包囊基質蛋白和14-3-3蛋白，共4種。本研究進一步為弓形蟲病的診斷和疫苗研究提供新的實驗依據。

弓形蟲；排泄分泌抗原；雙向電泳；免疫印跡；質譜

剛地弓形蟲是一種專性細胞內寄生蟲，能感染包括人在內的幾乎所有溫血動物，并引發多種嚴重危害人和動物生命健康的疾病。據估計，全世界約有1/3的人感染，通常呈隱性感染[1]，孕婦感染弓形蟲會引起多種胎兒疾病[2-4]。近年來，艾滋病(AIDS)患者不斷增多，并發的弓形蟲腦炎成為AIDS患者死亡的主要原因之一。因此，弓形蟲的防治越來越受到關注，而研制高效的弓形蟲疫苗成為當前最迫切的任務之一[5]。

目前已有的大部分疫苗，包括全蟲疫苗、排泄分泌抗原疫苗、核酸疫苗和基因工程疫苗等，但這些疫苗的效果并不是十分理想[5]，所以開發更加安全、有效的疫苗成為弓形蟲免疫預防的重要任務。弓形蟲排泄分泌抗原(excreted-secreted antigen，ESA)是蟲體在入侵宿主細胞及在細胞內增殖和細胞外游離過程中向血液、組織間隙、體腔液或培養上清液釋放的可溶性抗原成分，主要包括微線體蛋白(microneme protein，MIC)、棒狀體蛋白(rhoptry protein，ROP)和致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)等。大量研究顯示，弓形蟲ESA及其組分具有良好的反應原性及免疫保護性，表明其具有開發新型診斷試劑及良好疫苗的潛力[6-7]。因此，深入研究ESA的蛋白成分、生化及免疫學特性，對了解弓形蟲的抗原特性、致病機制、免疫保護等均具有重要價值。

我們通過雙向電泳結合蛋白質免疫印跡試驗，篩選與弓形蟲抗原性密切相關的一些蛋白質，并通過質譜成功進行鑒定，進一步為弓形蟲的診斷和疫苗及新型藥物的研究提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性昆明鼠，體重18～22 g，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所動物實驗中心。6月齡山羊，體重25～35 kg，購自甘肅省蘭州市榆中縣某羊場，經弓形蟲間接血凝試劑盒檢測為弓形蟲抗體陰性。

1.2 蟲株

弓形蟲GJS強毒株，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜寄生蟲病研究室保存。

1.3 細胞系

VERO細胞系由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜寄生蟲病研究室保存。

1.4 主要試劑

線性固相pH 梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條(pH 4～7，24 cm)等購自美國Bio-Rad公司，PMSF、HRP標記的抗羊二抗購自Sigma公司，PVDF膜購自美國Amersham公司，HRP-DAB底物顯色試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自美國GE公司，弓形蟲間接血凝檢測試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.5 弓形蟲速殖子的收集

將液氮凍存的弓形蟲速殖子細胞懸液(濃度為2.0×106·mL-1)取出后，迅速置于37 ℃水中溶解，腹腔注射昆明小鼠，每只0.5 mL。待其發病后，腹腔沖洗收集新鮮的弓形蟲速殖子懸液，4 ℃ 100×g 離心10 min，除去腹水中的小鼠細胞和碎片，上清液再次4 ℃ 200×g 離心10 min，收集的沉淀即為弓形蟲速殖子。用PBS調整速殖子到合適的濃度后，保存備用。

1.6 細胞培養與ESA收集

弓形蟲的培養和ESA的獲得參考T.A.Costa-Silva等[8]方法，ESA從感染弓形蟲的細胞培養基中獲得，方法如下：長勢良好的VERO細胞在接種弓形蟲之前，用PBS沖洗3次，加入新鮮的含1%胎牛血清的PRMI-1640，然后接種弓形蟲GJS株2.5×106個·mL-1，37 ℃共培養12 h后，倒掉細胞培養液，用PBS沖洗3次。再加入新鮮不含血清成分的PRMI-1640，在37 ℃溫箱培養約48 h后，收集含有ESA的細胞培養液，用0.22 μm的濾膜過濾后加入10 μg·mL-1的PMSF。樣品低溫凍干后，于-80 ℃保存。同時設未接種弓形蟲的細胞培養對照試驗組，培養方式和過程以及培養液中蛋白質的收集與試驗組完全相同。

1.7 蛋白質樣品的制備

向凍干的蛋白質粉末中加入適量的蛋白質抽提液(8 mol·L-1Urea，2% CHAPS，0.2% Bio-Lyte ampholytes，50 mmol·L-1DTT，1% IPG buffer pH 4～7)使其充分溶解。4 ℃ 10 000×g 離心15 min，收集上清液，即為粗蛋白質樣品。

采用TCA/丙酮沉淀法處理樣品：將粗蛋白質樣品用5倍體積的預冷丙酮(含10% TCA和20 mmol·L-1DTT)-20 ℃沉淀2 h，4 ℃ 12 000×g 離心15 min，再用預冷丙酮(含20 mmol·L-1DTT)沖洗3次，自然揮干。加入適量上樣緩沖液，溶解蛋白質。考馬斯亮藍法測定蛋白質樣品濃度后，分裝。直接用于雙向電泳或-80 ℃保存。

1.8 羊弓形蟲陰、陽性血清的制備

羊弓形蟲陰性血清：對體重為25～35 kg的山羊頸靜脈采血，1 000×g離心15 min，吸取血清，用弓形蟲間接血凝檢測試劑盒檢測其抗體滴度，確定該山羊為弓形蟲陰性后(抗體水平<1∶64)，保存血清，備用。

羊弓形蟲陽性血清：對體重為25～35 kg的山羊腹腔注射弓形蟲速殖子5 mL，濃度為2.0×106mL-1，10 d后，再次注射相同劑量的弓形蟲速殖子，如此重復5次后，頸靜脈采血，1 000×g離心15 min，吸取上層血清，用弓形蟲間接血凝檢測試劑盒檢測其抗體滴度，確定山羊弓形蟲陽性血清效價(抗體水平≥1∶64)，保存，備用。

1.9 蛋白質印跡(Western blotting)分析

弓形蟲ESA 10 μg 經過SDS-PAGE電泳分離后，進行轉膜，將膠上的蛋白質電轉至PVDF膜上，用制備的羊弓形蟲陰、陽性血清為抗體，HRP標記的抗羊二抗(1∶2 000)進行Western blotting分析。用HRP-DAB底物顯色試劑盒進行顯色。

1.10 弓形蟲ESA二維電泳分析

弓形蟲ESA 4 ℃融化后，加入上樣緩沖液(8 mol·L-1尿素，2% CHAPS，0.2% IPG Buffer，50 mmol·L-1DTT，0.002%溴酚藍)，混勻，4 ℃10 000×g離心10 min。按上樣量1 mg，總體積450 μL進行上樣。采用50 V，20 ℃進行主動水化12 h，然后直接進行等電聚焦總電壓時間為110 kVh。等點聚焦結束后將膠條進行兩步平衡。然后將平衡后的膠條移至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(24 cm×19 cm×0.1 cm)上進行第二向電泳，二向電泳的程序：1.5 W·gel-145 min，15 W·gel-1直到溴酚藍跑到底，約4 h 30 min 。

選取2014年3月至2017年3月在本院接受治療的結腸癌患者103例，將患者隨機分為兩組：實驗組51例(完整結腸系膜切除術)，對照組52例(傳統根治術)。

1.11 凝膠染色和蛋白質印跡(Western blotting)分析

將上述兩塊凝膠中的一塊進行考馬斯亮藍染色過夜，然后脫色至蛋白質點清晰可見、背景顏色較淺為止，用UMAX PowerLook 1100透射掃描儀獲取圖像并保存。另一塊進行轉膜，將膠上的蛋白質電轉至PVDF膜上，用制備的弓形蟲羊陰性、陽性血清為抗體，HRP標記的抗羊二抗進行Western blotting分析，最后使用ECL化學發光試劑盒將PVDF膜進行膠片曝光顯影定影，流水沖洗后干燥并照相保存。

1.12 免疫反應性蛋白的質譜鑒定

將發生免疫反應的蛋白質點從凝膠上切取下來，用超純水漂洗兩次后，加入脫色液(25 mmol·L-1NH4HCO3、50%乙腈的水溶液)，脫色30 min。吸出脫色液，加入脫水液Ⅰ(50%的乙腈溶液)，脫水30 min，吸出脫水液Ⅰ，加入脫水液Ⅱ(100%的乙腈)，脫水30 min，吸出脫水液Ⅱ，加入20 μL酶解工作液(含0.02 μg·μL-1胰蛋白酶的酶解覆蓋液)，吸脹30 min，加入10 μL酶解覆蓋液(25 mmol·L-1NH4HCO3、10%乙腈的水溶液)，37 ℃水浴酶解過夜，酶解后上清轉移至另一新離心管中，加入50 μL蛋白質萃取液于剩下的膠中，37 ℃溫浴30 min，5 000×g離心5 min，合并上清，凍干后待做質譜。將干粉重新溶解于5 μL含0.1%TFA的溶液中，然后按照1∶1的比例與含50% ACN和含1% TFA的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液混合，取1 μL樣品進行質譜點靶鑒定。

質譜鑒定后，在數據庫T.gondii6.2中搜索，搜索參數如下：酶為胰蛋白酶；允許最大漏切位點為1；固定修飾為Carbamidomethyl(C)；可變修飾為Oxidation(M)；MS tolerance為0.005%；MS/MS tolerance為0.5 u；Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

2 結 果

2.1 SDS-PAGE-WB

對收集到的蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳免疫印跡試驗(圖1)，弓形蟲ESA與羊弓形蟲陽性血清反應結果中，共有8個陽性條帶(如圖1)，分別出現在約15、20、26、36、38、54、62和130 ku，其中在36 ku附近的陽性條帶信號最強，而ESA與羊弓形蟲陰性血清反應沒有條帶出現(圖1)，對照組健康VERO細胞培養液中收集的蛋白質與羊弓形蟲陽性血清作用，未出現陽性反應條帶(圖1)。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.弓形蟲ESA蛋白與羊弓形蟲陽性血清反應結果；2.VERO細胞培養上清液與羊弓形蟲陽性血清反應結果；3.弓形蟲ESA蛋白與羊弓形蟲陰性血清反應結果M.Protein molecular weight marker；1.The reaction of the T.gondii excreted-secreted antigen and positive serum of T.gondii in goat；2.The reaction of the cell supernatant of VERO and positive serum of T.gondii in goat；3.The reaction of the T.gondii ESA and negative serum of T.gondii in goat圖1 免疫血清與抗原免疫印跡反應Fig.1 Reactivity of anti-Toxoplasma gondii sera with antigens in Western blotting

2.2 弓形蟲ESA的雙向電泳圖譜

2.3 2-DE-WB和質譜分析

f托氟沙星納米乳的制備及其急性毒性研究結果顯示共檢測到了18個陽性蛋白質點(圖3)。選擇了其中的6個斑點進行質譜分析，并成功對這6個蛋白質點進行鑒定，結果顯示它們屬于4種特定蛋白質，包括微線體蛋白1(microneme protein 1，MIC1)、 微線體蛋白4(microneme protein 4，MIC4)、包囊基質蛋白(cyst matrix protein)、14-3-3蛋白(14-3-3 protein)(表1)。

圖2 弓形蟲雙向電泳圖譜Fig.2 2-DE image of Toxoplasma gondii-infected excreted-secreted antigen

圖3 弓形蟲ESA免疫印跡得到的陽性蛋白質點Fig.3 Positive protein spots of Toxoplasma gondii excreted-secreted antigen identified by the Western blotting

表1 質譜鑒定的陽性蛋白質點

Table 1 Protein from excreted-secreted antigen ofToxoplasmagondiiidentified by mass spectrometry

位點號SpotNo．蛋白質登錄號AccessionNo．蛋白質名稱Proteinname分值Proteinscore蛋白質相對分子質量ProteinMW等電點PI覆蓋度Coverage1gi|211967270|micronemeprotein4，MIC4123651475．06172gi|211963364|cystmatrixprotein，putative234494644．89193gi|211963364|cystmatrixprotein，putative255494644．89234gi|211966195|micronemeprotein1，MIC1110496255．15205gi|237832223|14?3?3protein，putative75373795．05136gi|237832223|14?3?3protein，putative81373795．0527

3 討 論

弓形蟲ESA在弓形蟲入侵宿主細胞和細胞內存活過程中，都起到關鍵作用，組分較為復雜。ESA具有良好的反應原性及免疫保護性，多種弓形蟲免疫效果良好的蛋白質，如GRA6[9]蛋白等，都是其重要的組成成分。本文利用從感染弓形蟲的VERO細胞培養基上清收集的弓形蟲ESA進行免疫反應原性檢測，以篩選具有免疫原性的弓形蟲排泄分泌抗原。SDS-PAGE-WB結果共檢測到了8個陽性條帶，與已報道的相關研究結果相一致[10-11]，并且對照組試驗中沒有出現陽性反應條帶。其中36 ku附近的陽性條帶信號最強，表明該蛋白質條帶具有較好的反應原性。根據已有的研究顯示多種蛋白質的相對分子質量在36 ku附近，例如MIC6、MIC7、GRA4以及GRA10等。20 ku的條帶可能與MIC5、GRA1和GRA2密切相關，26 ku的蛋白質條帶則與GRA7的相對分子質量一致，另外MIC3和ROP9的相對分子質量大小也正好與38 ku的條帶匹配，而ROP2蛋白家族的多個成員的相對分子質量大小則分布于54和62 ku，正好與本文的結果相一致[1，10，12-15]。

通過雙向電泳考馬斯亮藍染色圖譜共檢測到超過1 000個蛋白質斑點，其等電點主要分布于4.0～7.0，并結合蛋白質免疫印跡技術共檢測到了18個具有免疫原性的蛋白質點，其中一些蛋白質點緊密靠在一起，根據經驗判斷極有可能是同一蛋白質的不同修飾類型所造成，所以對于這類蛋白質選取其中具有代表性的6個蛋白質斑點進行質譜分析和數據庫檢索，并成功對其進行了鑒定，它們歸屬于4種特定蛋白質，包括MIC1、MIC4、包囊基質蛋白(cyst matrix protein)和14-3-3蛋白(14-3-3 protein)。

MIC1和MIC4是由位于弓形蟲蟲體前端的分泌器官——微線體分泌的蛋白質，是一種重要的宿主結合蛋白，與蟲體識別和結合宿主密切相關，它們常與MIC6結合形成復合體而發揮作用，且這種復合體對分泌運輸過程起著至關重要的作用[12，16-17]。本研究中MIC1和MIC4均被羊抗弓形蟲血清檢測到，表明其具有良好反應原性。對MIC1和MIC4已有的研究顯示，它們具有良好的免疫保護性，用其研制的疫苗免疫小鼠能夠引起顯著的體液和細胞免疫應答，并延長小鼠的存活時間[18-19]。

包囊基質蛋白又叫基質抗原1(matrix antigen 1，MAG1)，表達于寄生蟲組織包囊、包囊基質和包囊壁，在弓形蟲速殖子和緩殖子階段均有表達，但在后者具有更高的表達[20]。M.Di Cristina等[21]的研究顯示MAG1能夠引起特異性的B、T細胞免疫應答反應，免疫保護試驗也證實其具有一定的免疫保護性[22]，同時也在弓形蟲的診斷上顯示出巨大的潛力。目前對MAG1的研究還非常有限，可能具有介導黏附和侵入宿主細胞的作用[21]，還需要進一步的研究。

14-3-3蛋白廣泛存在于真核細胞內，并且具有高度的保守性，參與多種重要細胞生理過程，主要包括細胞質信號轉導、細胞周期的調控和細胞凋亡等，對真核生物具有重要意義[23-24]。目前，已經對包括弓形蟲在內的多種寄生蟲的14-3-3蛋白進行了研究，結果顯示由其制備的多種疫苗均具有一定的免疫保護作用，而由14-3-3蛋白作為抗原進行ELISA檢測，顯示出高度的敏感性和特異性，表明14-3-3蛋白是良好的疫苗和診斷試劑候選分子。本研究中6號斑點14-3-3蛋白信號非常強，表明其具有良好的反應原性。

4 結 論

應用雙向電泳和免疫印跡技術，對弓形蟲具有強免疫原性的排泄分泌抗原中具有的蛋白質組分進行了篩選，分析發現，篩選到18個免疫顯性蛋白質點，并對其中6個具有代表性的蛋白質點進行質譜鑒定，顯示為微線體蛋白1、 微線體蛋白4、包囊基質蛋白和14-3-3蛋白。

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(編輯 白永平)

Identification of High Immunogenic Components ofToxoplasmagondiiExcreted-secreted Antigens

YE Qiang1，WANG Meng1，ZHANG Nian-zhang1，YIN Hong1，2，ZHANG De-lin1，2*

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology，KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandCentralofImportantAnimalInfectiousDisease，Yangzhou225009，China)

The objective of this study was to screen the main immunogenic antigen ofToxoplasmagondiiexcreted-secreted antigen(ESA).2-DE combined with Western blotting were used to analysis the components ofT.gondiiESA.Eighteen positive protein points were detected in this study.Among them，6 protein spots were selected to identify by matrix-assisted laser desorption/lionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF)，belonging to microneme protein 1，microneme protein 4，cyst matrix protein and 14-3-3 protein.This study provides a new reference for looking for new candidate molecules for prevention and diagnosis of toxoplasmosis.

Toxoplasmagondii；ESA；2-DE；Western blotting；mass spectrometry

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.020

2015-02-12

甘肅省創新研究團體計劃項目(1210RJA006)；國家肉牛牦牛產業技術體系(NBCIS CARS-38)

葉 強(1986-)，男，四川綿陽人，碩士，主要從事蛋白質組學研究，E-mail：yeqiang251@163.com

*通信作者：張德林，E-mail：zhangdl2005@163.com

S852.729

A

0366-6964(2015)11-2063-06