局部注射丹參酮Ⅱ-A對正畸過程中牙周膜VEGF表達的影響*

楊夏晴， 張軍梅， 王藪馨， 馮安琪， 莫朝倫

(1.貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫學院附院 口腔科， 貴州 貴陽 550004)

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局部注射丹參酮Ⅱ-A對正畸過程中牙周膜VEGF表達的影響*

楊夏晴1，2， 張軍梅1**， 王藪馨1， 馮安琪1， 莫朝倫1

(1.貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫學院附院 口腔科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 研究局部注射丹參酮Ⅱ-A對正畸牙移動過程中牙周膜壓力側VEGF表達的影響。方法: 選取20只兔，隨機均分為第1、3、7，14和21天組，復制兔雙側下頜第一磨牙的正畸牙移動模型，以左側下頜第一磨牙作為實驗組，每日1次于近中牙齦黏膜下注射丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液0.36 mg/d，右側注射等量生理鹽水作為對照組，分別于持續注射后1、3、7、14、21 d時麻醉處死動物，切取雙側下頜第一磨牙及周圍組織制成牙周組織切片，觀察VEGF的相對表達量，測量下頜第一磨牙移動距離。結果： 除第1天組外，其余各個時間點實驗組牙移動距離大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；第3、7、14、21天各組VEGF平均染色強度高于第1天，且實驗組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，第7天實驗組VEGF平均染色強度最高，差異有統計學意義(P<0.01)。結論： 丹參酮Ⅱ-A促進牙移動過程中血管內皮細胞VEGF表達，增加新生血管的數量，對加速正畸牙移動有一定的作用。

丹參酮II-A；兔；血管內皮生長因子；正畸學；牙移動

正畸牙移動是通過牙槽骨改建來實現的，牙槽骨改建與牙周膜的血管改建關系緊密，牙周膜內存在良好的血液循環能為牙槽骨改建創造有利的物質代謝環境，骨改建的速度影響牙齒移動的快慢。丹參酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ A，TsⅡA)具有擴張血管和促進血管新生作用[1]，臨床上主要用于心血管系統疾病。近幾年，有學者首次將TsⅡA用于正畸復發，但TsⅡA對牙移動的影響未見報道。本實驗擬在建立正畸牙移動模型的動物體內，采用局部注射TsⅡA，選取不同的時間點觀察藥物對正畸牙移動的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

VEGF免疫組化試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產品，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液為上海第一生化藥業有限公司生產，國藥批字號H310225588。 健康成年雄性大耳白兔20只，體質量(2.5+0.2)kg，由貴陽醫學院動物實驗中心提供。隨機均分為第1、3、7、14、21天組，每組4只，適應性喂養1周。

1.2 實驗方法

1.2.1 復制正畸牙移動模型

2%戊巴比妥鈉經耳緣靜脈1 mL/kg麻醉兔并固定，使用個別托盤制取兔下頜牙印模，石膏灌模；牙科慢速手機噴灑蒸餾水，于雙側下頜第一磨牙及切牙近頸部同一水平磨0.3 mm深的固位溝，于下頜前牙與第一磨牙之間安裝鎳鈦拉簧，測量力值大小約80 g；下頜兩顆切牙用正畸結扎絲連扎，牙釉質粘結劑輔助粘接加強固位[2]。定期檢查矯治器情況，如有脫落及時補救。

1.2.2 給藥劑量及部位

0.36 mg/d TsⅡA磺酸鈉注射液[3]，每日一次于左側下頜第一磨牙近中牙齦黏膜下注射(實驗組)，右側同名牙位置注射等量生理鹽水(對照組)，直至麻醉處死動物。

1.2.3 制作牙周組織切片

分別于第1、3、7、14、21天麻醉動物，再次取印模，石膏灌模。按照倫理學方法處死動物，立即取雙側下頜第一磨牙及周圍牙槽骨組織，置入4%多聚甲醛固定24 h，使用10%EDTA Na2·2H2O液進行脫鈣處理，每3 d更換一次脫鈣液，直至完全脫鈣。脫水、石蠟包埋，切成沿牙體長軸、近遠中向2 μm厚的切片。

1.2.4 免疫組化染色

60 ℃烤片50 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各30 min，梯度乙醇各5 mm，高壓檸檬酸鹽抗原修復3 min，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min， 羊血清封閉液10 min，滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加二抗37 ℃孵育30 min， 新鮮配制DAB顯色劑顯色3 min，蘇木素復染1min，脫水封片鏡下觀察。

1.3 觀察指標

1.3.1 測量牙移動距離

用電子游標卡尺測量石膏模型上，雙側下頜第1磨牙近中面到下頜切牙遠中面的距離。測量由同一人進行，測量3次取平均值。△d(第一磨牙移動距離，mm)=d1(牙移動前距離)-d2(牙移動后距離)。

1.3.2 VEGF表達半定量分析

VEGF陽性表達結果是血管內皮細胞的胞質中出現黃色顆粒至棕褐色顆粒。用Bresalier等的半定量公式計算。用雙盲法在每張切片壓力側牙周膜內，200倍顯微鏡下隨機選擇10個視野進行觀察。染色強調分為4級并記分: 陰性，細胞無染色，記0分；弱陽性，細胞染為淺黃色，記1分；中度陽性，細胞染為棕黃色，記2 分；強陽性，細胞染為棕褐色，記3 分。根據公式計算切片的平均染色強度(Is )：Is =Σ{ (0 ×F0) +(1 ×F1) + (2 ×F2) + (3 ×F3) } , F = % ×10；式中F 為每一強度級別的視野數。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 下頜牙移動距離

第1天實驗組及對照組牙齒移動距離無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。第3、7、14、21天實驗組與對照組兔牙移動距離隨著時間的變化不斷增加，實驗組牙移動距離均大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組家兔不同時間點牙移動距離 (mm)Tab.1 Comparison of tooth movement distance in different groups

2.2 VEGF的表達

1 d對照組和實驗組VEGF平均染色強度都較少，差異無統計學意義(P>0.05)。3、7、14和21 d的實驗組和對照組VEGF平均染色強度均有不同程度的增加，與1 d比較差異有統計學意義(P<0.05)，峰值在加力第7天，實驗組和對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。在加力3 d和14 d時，實驗組牙周膜內血管擴張較對照組明顯，見圖1(a、b、e、f)。在加力7 d和14 d時，兩組牙周膜受壓側可觀察到較多新生血管，且實驗組比對照組新生血管數量多，單位面積內的血管密度增加，見圖1(c、d、e、f)。

表2 兩組家兔不同時間點壓力側牙周膜內VEGF平均染色強度Tab.2 Comparison of average intensity of VEGF staining in pressure periodontal membrane in different groups

注：a、c、e分別為3、7、14 d對照組，b、d、f分別為3、7、14 d實驗組

3 討論

正畸力作用于牙齒，引起受壓側牙周膜內血管管腔變窄，血管通透性改變，血流與血管成分異常，影響組織間的物質交換、營養及代謝廢物的運輸[4]。局部區域內血流完全阻斷后，細胞結構消失發生玻璃樣變性和潛掘性吸收，降低骨改建的速度從而延遲牙齒移動；恢復缺血區域的血供利于骨改建。本研究立足于TsⅡA的藥理作用，旨在將TsⅡA與正畸牙移動相結合進行動物實驗。

VEGF是體內發現的最為有效的促血管生成因子之一，可特異性地作用于血管內皮細胞，誘導內皮細胞增殖、出芽、遷移和形成管腔，減少內皮細胞的凋亡，修復損傷內皮細胞并維持血管完整性[5]。相關實驗研究表明，VEGF與血管內皮細胞內的酪氨酸酶的受體結合后介導受體進行磷酸化反應，激活血管內皮細胞內的信號轉導，誘導內皮細胞活化，增加血管內皮祖細胞增殖及遷移能力，有強效的促血管生成作用；研究還發現低氧環境中VEGF的表達約為有氧環境的8倍[6]。本實驗在加力7 d和14 d時，兩組牙周膜受壓側可觀察到較多新生血管，且實驗組比對照組新生血管數量多，單位面積內的血管密度增加，VEGF平均染色強度均增強，差異有統計學意義，提示注射TsⅡA可能增加VEGF表達促進新生血管數量，這一結果與TsⅡA能促進內皮細胞分泌VEGF的報道相一致[7]。在加力3 d和14 d時，實驗組牙周膜內血管擴張較對照組明顯。相關研究表明VEGF擴血管作用是通過誘導內皮細胞合成NO合成酶，增加NO的釋放，提高血管通透性，引起血管舒張[8]。本實驗結果提示注射TsⅡA可能通過上調VEGF表達，舒張血管作用較對照組明顯。

正畸牙移動過程中，壓力側牙周膜內不可避免的出現微循環障礙，通過上調VEGF的表達，修復損傷的血管，促進血管新生，快速建立有效的側支循環，改善牙周膜內缺血缺氧狀態，減少組織代謝障礙，為骨改建創造良好的微環境。實驗結果表明，局部注射Ts II A能促進正畸牙移動，促進牙周血管內皮細胞VEGF表達，有利于牙移動。

[1] 李玉萍，顧兵，劉建濤，等.丹參酮Ⅱ-A的研究進展[J].時珍國醫國藥， 2010(7)：1170-1172.

[2] 黃艷，王旭霞，張君，等.正畸牙移動實驗動物模型的建立[J].口腔醫學雜志， 2007(2):64-66.

[3] 張世英，劉繼光 ，趙剛.丹參酮Ⅱ A局部注射正畸牙移動后復發階段破骨細胞分化因子的表達.中國組織工程研究， 2014(11)：1731-1736.

[4] Obi S, Masuda H, Yamamoto K, et al. Fluid shear stress induces differentiation of circulating phenotype endothelial progenitor cells[J].Am Physiol Cell Physoil， 2012(6)：595-606.

[5] 蘇曉艷 ，宋 軍 ，高冬.血管內皮生長因子與血府逐瘀湯促血管新生的比較研究[J].中國中醫基礎醫學雜志， 2014(8):1128-1130.

[6] 楊彥，陳慶偉，曹廣煜，等.丹參酮ⅡA增效大鼠骨髓源性內皮祖細胞VEGF、SDF-1表達[J].激光雜志， 2012(2)：83-86.

[7] 唐新寶，劉靜.正畸牙移動中牙周組織內VEGF動態變化的研究[J].實用醫學雜志， 2005(14)：1502-1504.

[8] 馬躍東，李德華.VEGF在心血管疾病治療中作用的研究進展[J].中國老年學雜志， 2011(9)1703-1705.

(2015-02-25收稿，2015-04-09修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 趙 毅

Effect of Local Injections of Tanshinone Ⅱ-A on VEGF Expression of Periodontal Membrane in Rabbit Orthodontic Tooth Movement

YANG Xiaqing1，2， ZHANG Junmei1， WANG Souxin1， FENG Anqi1， MO Chaolun1

(1.GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofDentistry，theAffiliatedHospitalofGuiyangMedialCollege，Guiyang550004，Guizhou，China)

Objective: To investigate the effect of local injection of tanshinone Ⅱ-A on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression of periodontal membrane in orthodontic tooth movement. Methods: Twenty rabbits were randomly divided into 5 groups and named as 1stday group, 3rdday group, 7thday group, 14thday group and 21stday group with four rabbits in each. Copying the orthodontic tooth movement model of the bilaterally first molar of rabbits to measure the mesial movement distance of the mandibular first molar on the plaster model at different time. 0.36 mg/d of tanshinone Ⅱ-A sulfonate was injected into the mesial gingival mucosa of the left first molar once a day, which served as the experimental group, the same amount of normal saline (NS) was injected into the right molar served as the control group. After injecting for 1, 3, 7, 14 and 21days, the rabbits were put to anesthesia death and cut out the organization to make slice. The periodontal tissue change and the expression of VEGF were observed. Results: Except for the 1st day group, the tooth movement distance of the experimental group were larger than that of control group and the difference was statistically significant (P<0.05). On 3rd, 7th, 14thand 21stday, all groups' VEGF average color intensity were higher than that of the control group and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusions: The experiment indicates that tanshinone Ⅱ-A can effectively increase the VEGF expression and the number of vascular, and have certain effect to accelerate the orthodontic tooth movement.

tanshinone II-A; rabbit；vascular endothelial growth factor; orthodontics; tooth movement

貴陽市科技局基金筑科合同(20141001)40號

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1246.015.html

R783.5

A

1000-2707(2015)05-0467-04

**通信作者 E-mail:zjm46688@126.com