都勻毛尖對小鼠肝臟CYP3A酶活性及其mRNA水平的影響*

王筑婷， 李紅梅， 雷霆雯

(貴陽醫學院 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽 550004)

?

都勻毛尖對小鼠肝臟CYP3A酶活性及其mRNA水平的影響*

王筑婷， 李紅梅， 雷霆雯**

(貴陽醫學院 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽 550004)

目的： 研究綠茶對細胞色素P450 3A(CYP3A)酶活性及其mRNA水平的影響，推測綠茶對藥物代謝的作用。方法： 綠茶選用都勻毛尖，120只昆明種雄性小鼠隨機分為4組，對照組正常飲食飲水，低、中、高劑量綠茶組分別予0.25 g/(kg·d)、0.5 g/(kg·d)、1.0 g/(kg·d)都勻毛尖茶湯灌胃，分別在1周、2周、3周時處死小鼠，測定小鼠肝臟微粒體CYP3A的活性，并用RT-PCR技術檢測小鼠肝臟中CYP3A11 mRNA水平。結果： 都勻毛尖能抑制CYP3A酶活性，呈時間-劑量依賴性；都勻毛尖可抑制CYP3A11mRNA表達，且呈時間-劑量依賴性。結論： 都勻毛尖對CYP3A的酶活性及mRNA水平均呈時間-劑量依賴性抑制作用，提示都勻毛尖可能通過影響CYP3A酶活性對藥物的代謝發揮作用。

綠茶；細胞色素P450；酶活性；代謝解毒，藥物

細胞色素P450酶是細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)基因超家族編碼形成的一組酶蛋白[1]，哺乳動物CYP450可分為3類，其中微粒體CYP450是主要的一類，由多個基因家族組成(CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP17、CYP19、CYP21)。CYP3A是CYP450酶系中最主要的一類，近一半藥物都經過CYP3A代謝，CYP3A一方面能催化藥物發揮藥效，另一方面加速藥物清除[2]。因此CYP3A的活性可用于研究藥動學、藥物或毒物的代謝、藥物相互作用、藥物代謝酶的遺傳多態性及疾病與代謝酶的相互影響。茶葉原產于中國，我國的產茶區遍及全國19個省區、1 000余個縣市，全世界有160多個國家都在飲茶[3]。作為保健品，綠茶較多地保留了鮮葉內的天然物質[4]，對其研究多集中于提取物兒茶素或茶多酚，綠茶對CYP3A的酶活性有何影響尚未見報道。本研究觀察都勻毛尖的茶湯對CYP3A酶活性及mRNA表達的影響，以了解其對藥物代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

都勻毛尖(散裝，購于都勻毛尖茶直銷專賣店)。昆明種雄性小鼠(貴陽醫學院動物中心)，體質量(30±3)g。Bradford蛋白質定量試劑盒(北京天根生物技術有限公司)、氨基比林、NADP+、6-磷酸葡萄糖二鈉、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、焦碳酸二乙酯 (DEPC)、Trizol、氯仿/異戊醇(24∶1)、異丙醇、PCR擴增試劑、瓊脂糖(均購于上海生工生物工程技術服務有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒、DNAGREEN綠如藍低毒核酸染料(均購于北京天恩澤基因科技有限公司)、DNA Marker (FERMENTAS公司)、RT-PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，CYP3A11引物：上游為5′-TGACAAACAAGCAGGGAT-3′，下游為5′-CTGGTGAATGTGGGGGAC-3′、β-Actin引物：上游為5′-TGCGTTTTACACCCTTTC-3′，下游為5′-AGTCCTCAGCCACATTTG-3′。

1.2 方法

1.2.1 綠茶的制備 分別將1.5 g、3 g、6 g 綠茶加入100 mL沸水中，浸泡30 min，用兩層紗布過濾，即得低劑量組(0.25 g/kg)、中劑量組(0.5 g/kg)及高劑量組(1 g/kg)茶湯，灌胃準備[5]，所用茶湯均每日現配。1.2.2 動物分組 雄性昆明種小鼠120只，隨機分為1個對照組及3個實驗組，每組30只。實驗組分為低劑量組(0.25 g/kg)、中劑量組(0.5 g/kg)及高劑量組(1 g/kg)，對照組正常飲食飲水，各實驗組每日給予各自濃度茶湯灌胃后正常飲食飲水，灌胃量為0.5 mL，每日灌胃一次，連續灌胃1周、2周、3周后每組各處死動物10只。

1.2.3 制備微粒體 鈣沉淀法制備微粒體懸液，按照文獻[6] 操作。肝微粒體蛋白質濃度測定用Bradford蛋白質定量試劑盒，按照說明書操作。

1.2.4 CYP3A酶活性的測定 通過測定紅霉素N-脫甲基酶活性反映CYP3A酶活性,具體操作按照文獻[7]進行。

1.2.5 CYP3A11基因轉錄水平檢測 肝組織總RNA的提取，按Trizol試劑說明書提取肝組織總RNA，沉淀用RNase-free H2O溶解，測定260 nm和280 nm時的 OD值，判斷RNA的純度，計算RNA濃度，按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA[8]。PCR擴增體系總體積25 μL，預變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火51 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，終末延伸72 ℃ 7 min，30個循環[9]。制2%瓊脂糖凝膠，每100 mL凝膠加8 μL DNAGREEN， 0.5×TBE電泳緩沖液、100 V電壓電泳50 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，在凝膠成相分析系統上照相觀察結果并記錄，計算CYP3A11基因與β-Actin基因擴增條帶表達量像素灰度的比值作為mRNA表達的相對水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CYP3A酶活性

隨著綠茶作用時間的延長和劑量的增大， CYP3A的酶活性逐漸降低。各組比較后差異有統計學意義，P<0.01。見圖1、表1。

圖1 都勻毛尖對各組小鼠肝微粒體CYP3A酶活性的影響Fig.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome

表1 都勻毛尖灌胃不同時間對小鼠肝微粒體CYP3A酶活性的影響Tab.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrations on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome at different time points

(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與用藥1周組比較，P<0.01；(3)與用藥2周組比較，P<0.01；(4)與低劑量組比，較，P<0.01；5)與中劑量組比較，P<0.01

2.2 CYP3A11 基因的RT-PCR分析

隨著綠茶作用時間的延長和劑量的增大， CYP3A11 mRNA的表達逐漸降低。各組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2、表2。

3 討論

微粒體CYP450與NADPH-CYP450氧化還原酶及脂質雙層共同構成混合功能氧化酶系(mixed function oxidase system ,MFOS)，負責藥物、致癌物、環境化合物、一些內源性生成物的生物轉化作用[10]。CYP450的抑制和誘導可改變一些藥物、環境化合物、前致癌物等在體內的代謝[11]。在所有的CYP450酶中，CYP3A因含量豐富及底物范圍廣泛而具有相當的重要性，約有40%～50%的藥物在人體的代謝都經由CYP3A催化。因此CYP3A酶活性增高，藥物的代謝速率加快、半衰期縮短、血藥濃度降低，常規劑量給藥常不能取得預期臨床療效；酶活性降低，則藥物清除率降低、半衰期延長、易出現藥物蓄積引起的各種藥物不良反應。因此CYP3A活性的研究，可為預測最佳給藥劑量以達到提高藥物治療效果、減少不良反應的目的。CYP3A代謝的藥物主要有硝苯地平、紅霉素、特非那丁、咪達哇苯妥英、美替沙侖、皮質激素、環孢霉素、地西泮和嗅派醇酮等。CYP3A家族中在成人肝臟參與藥物代謝的主要是CYP3A4，在小鼠體內，參與藥物代謝的CYP3A亞系包括CYP3A11、CYP3A13、CYP3A16、CYP3A25、CYP3A41、CYP3A44、CYP3A57、CYP3A59等，其中CYP3A11是含量最豐富也是最重要的亞型之一，占肝臟中CYP450總含量的20%以上[12]。由于CYP3A家族擔負了大部分藥物及人體內源性物質的代謝，因此當其活性受到影響，會引起這些藥物在體內的代謝發生改變或影響藥效，或蓄積而引起中毒現象及發生藥物副作用。

注：“對”為對照組，L1、L2、L3 分別為毛尖低劑量1周組、2周組、3周組，M1、M2、M3分別為毛尖中劑量1周組、2周組、3周組，H1、H2、H3分別為毛尖高劑量1周組、2周組、3周組

表2 都勻毛尖灌胃不同時間對小鼠CYP3A11 mRNA表達的影響Tab.2 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrationson the mRNA expressions of CYP3A11 of mice liver microsome at different time points

(1)與對照組比較P<0.01；(2)與用藥1周組比較P<0.01，(3)與用藥2周組比較P<0.01；(4)與低劑量組比較P<0.01，(5)與中劑量組比較P<0.01

本實驗結果顯示，都勻毛尖呈時間-劑量依賴性抑制CYP3A的酶活性，同時也使CYP3A11 mRNA的表達呈時間-劑量依賴性降低 ，說明都勻毛尖可能是通過降低CYP3A11轉錄水平來使酶活性受到抑制的，因此由CYP3A代謝的藥物如與都勻毛尖茶湯同時使用可能會使這些藥物在體內的代謝減慢，長期使用可能會造成蓄積甚至中毒，引起一些不良的藥物反應。

[1] Ingelman SM. Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy: the past, present and future [J]. Trends Pharmacol Sci, 2004(4):193-200.

[2] 張藝婷，王曉飛，魏之昀，等. Has-miR-660負調控人類肝臟組織中藥物代謝酶CYP3A4的表達[J].復旦學報：醫學版, 2013(5):505-510.

[3] 韋友歡，黃秋嬋，陸維坤．解讀茶葉與人體健康[J]．廣東茶業， 2008(1):24-27．

[4] 黃秋嬋，韋友歡. 綠茶功能性成分對人體健康的生理效應及其機制研究[J].安徽農業科學, 2009(17):7975-7976,7990.

[5] 李佳，陳路軍，陳潔，等. 酒后飲綠茶對小鼠腎功能影響的實驗性研究[J].探索性醫學綜合實驗—教學改革與實踐, 2007(5):21-29.

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].2版. 北京：人民衛生出版社， 1994:512-512.

[7] 張均田.現代藥理實驗方法 [M]. 北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社， 1998:1652-1652.

[8] Elliott D. A proteomic analysis of liver mitochondria during acute endotoxeomia[J]. Intensive Care Med, 2006(32):1252-1262.

[9] Zhang QY， Debble Dunbar. Characterization of mouse small intestinal cytochrome P450 expression[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2003(11):1360-1351.

[10]周宏灝.遺傳藥理學[M].2版.北京：科學出版社， 2001:62-62.

[11]王福宏，王福力.桂枝湯對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶活性的影響[J].中華中醫藥學刊, 2014(11):2780-2782．

[12]van-Herwaarden AE, Wangenaar E, vanderR-Kruijssen CM, et al. Knockout of cytochrom P450 3A yields new mouse models for understanding xeonbiotic metabolism [J]. J Clin Invest, 2007(11):3583-2592.

(2015-02-25收稿，2015-03-15修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

醫學名詞術語使用規范

名詞、術語應統一，不要一義多詞或一詞多義。婦產科學、耳鼻咽喉科學、血液病學、呼吸病學、內分泌學、眼科學和外科學的名詞已由醫學名詞審定委員會審定公布，應嚴格執行，其它尚未審定者，目前以下列2個主題詞索引為準：(1)《醫學主題詞注釋字順表中文索引》(中國醫學科學院醫學信息研究所)；(2)《中醫藥主題詞表》(中國中醫研究院圖書情報研究所)。在這2個主題詞表中找不到者，則以人民衛生出版社出版的《英漢醫學詞匯》、化學工業出版社出版的《藥名詞匯》和科學出版社出版的各學科名詞審定本為準。如“發燒”應改為“發熱”，“紅血球”應改為“紅細胞”，“血色素”應改為“血紅蛋白”，“剖腹產術”應改為“剖宮產術”等。國內尚無統一譯名的，參考以上詞典慎重擬定，并在譯名后加括號加注外文，在醫學名詞審定委員會正式公布后，應立即嚴格遵照執行。

《貴陽醫學院學報》編輯部

Effect of Duyun Mao Jian Tea on Enzymatic Activities and mRNA Expression of CYP3A in Mouse Liver

WANG Zhuting, LI Hongmei, LEI Tingwen

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To study the effects of green tea (Duyun Mao Jian tea ) on enzymatic activity and mRNA expression of cytochrome P4503A(CYP3A)in mouse liver and to analyze its effect on drug metabolism. Methods: Kunming male mice were randomly divided into four groups. Control group was given food and water as normal, and the other three groups were were given Duyun Mao Jian tea-soup at doses of 0.25 g/(kg·d), 0.5 g/(kg·d) and 1 g/(kg·d) by gavage respectively for 3 consecutive weeks at most. The mice were killed at 1stweek, 2ndweek and 3rdweek respectively and the mice liver microsome were extracted. Then the enzymatic activity of CYP3A was determined by spectrophotography. RT-PCR was adopted to detect mRNA expression levels of CYP3A11. Results: Duyun Mao Jian Tea could inhibit the enzymatic activity of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently. Meanwhile, Duyun Mao Jian Tea inhibited the mRNA expression of CYP3A11 not only time-dependently but also dose-dependently. Conclusions: Duyun Mao Jian Tea can inhibit the enzymatic activity and mRNA expression of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently, indicating that Duyun Mao Jian tea can affect drug metabolism by inhibiting enzymatic activity of CYP3A and in turn may result in some side-effect.

green tea; cytochrome P450; enzyme activity; metabolic detoxication, drug

貴陽醫學院院基金(K2009-9)

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1316.032.html

R34-33; R969.1

A

1000-2707(2015)05-0471-04

**通信作者 E-mail:leitw@sina.com