3種癲癇模型的制備及應用分析*

陳中瑋, 周 鑫, 王麗琨, 伍國鋒

(貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004)

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3種癲癇模型的制備及應用分析*

陳中瑋, 周 鑫, 王麗琨, 伍國鋒

(貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討不同癲癇模型的制備及其在癲癇研究方面的應用。方法： 選擇成年雄性SD大鼠60只隨機分為杏仁核慢點燃組、杏仁核快點燃組、注射匹羅卡品組，每組20只動物，觀察各組大鼠的點燃率，模型大鼠癲癇發作級別及癲癇行為Racinel 評分，同時觀察模型大鼠癲癇發作時的腦電圖。結果： 成功獲得各組癲癇模型動物，各組Racinel評分差異有統計學意義(P<0.05)，其中慢點燃組動物持續時間較長，快點燃組出現典型癲癇行為較早，匹羅卡品組動物存活時間長。結論： 與杏仁核電點燃模型相比，匹羅卡品點燃癲癇動物成功率高，癲癇行為保持時間較久，能更好的為臨床所應用，但匹羅卡品所致癲癇大鼠癇性發作持續時間變異較大，這可能為臨床篩藥帶來了一定的不便。

癲癇；疾病模型，動物；匹羅卡品；大鼠，Sprague-Dawley

癲癇是一種以大腦局部病灶突發性的異常高頻放電并向周圍組織擴散為特征的大腦功能障礙，同時可伴隨短暫的運動、感覺、意識及自主神經功能異常，具有病因多樣性、發作反復性、癥狀復雜性、表現形式刻板性等特點[1]。據不完全統計，全世界有5千萬的癲癇患者，且其平均每年發病率為0.5‰～1‰[2]。發作時的臨床表現可分為全面強直-陣攣發作(大發作)、單純部分發作、復雜部分發作、失神發作(小發作)、癲癇持續狀態[3-5]。既往多采用苯巴比妥、丙戊酸鈉等藥物治療癲癇，但服藥期間部分病例出現了認知功能障礙及肝臟損害等嚴重不良反應，因此，尋求療效滿意且不良反應小的廣譜抗癲癇藥物，成為目前研究的熱點[6-7]。本研究結合目前癲癇模型制備常用的技術手段，擬采用同批次SD大鼠實驗動物，通過不同方式獲得癲癇模型，分析模型動物的表現、腦電圖描記數據及模型動物的存活時間等，以期發現不同制備方法獲得的癲癇模型的特征，為臨床藥物研究和治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

60只成年雄性SD大鼠均購自動物研究中心，7～8周齡，平均體質量(223.5±1.3)g，隨機分為杏仁核慢點燃組、杏仁核快點燃組、注射匹羅卡品組，每組20只動物，所有動物均首先置于實驗室獨立空間內，保持屋內溫度濕度恒定，采用單籠喂養，自由進食的方式飼養1周讓動物適應環境，開始實驗前至少禁食12 h。

1.2 動物模型制備

1.2.1 杏仁核慢點燃模型 將大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射(4 mL/kg)麻醉后固定于腦立體定位儀上，在右側杏仁基底外側核的顱骨表面投射點鉆孔，將直徑為0.1 mm的雙極螺旋漆包鎳鉻電極植入右側杏仁基底外側核(杏仁核坐標定位：前囟后2.8 mm，中線旁開4.9 mm，顱骨表面下8.6 mm)術后第7天，開始對大鼠右側杏仁核進行電刺激。刺激強度從20 μA開始，每次在原來刺激強度的基礎上增加20%，刺激頻率60 Hz，波寬1.0 ms，串刺激；間隔5 min刺激1次，直至出現時程>3 s的杏仁核后放電，此時電流強度即為點燃前后放電閾值(ADT)。測定ADT后10 min進行點燃刺激，大鼠連續出現3次5級發作定義為點燃成功。動物連續出現3次大發作間歇24 h后，用點燃前方法測定點燃后ADT。根據Racine分級法進行發作強度判定。1.2.2 杏仁核快點燃模型 手術同前，刺激強度從20 μA開始，每次在原來刺激強度的基礎上增加20 μA，刺激頻率16 Hz，波寬1.0 ms，串刺激；間隔2 min刺激1次，直至出現時程>3 s的杏仁核后放電，此時電流強度即為ADT。測定ADT后10 min進行點燃刺激，刺激方式為串刺激，刺激頻率16 Hz，波寬1.0 ms，波間隔61.50 Hz，強度500 μA，間隔7 min再次刺激，直至大鼠連續出現3次5級發作，定義為點燃成功。根據Racine分級法進行發作強度判定。

1.2.3 匹羅卡品模型 大鼠腹腔注射氯化鋰125 mg/kg,18～20 h后再給予匹羅卡品30 mg/kg腹腔注射,30 min后如無發作按同樣劑量注射，直至發4～5級大發作，最多可注射4次藥，發作90 min后用安定進行鎮靜。

1.3 觀察指標

1.3.1 行為學觀察 按照Racinel 經典的癲癇發作行為評分標準進行評分:無任何癲癇發作行為記0分; 凝視發作記1分; 規律性點頭或濕狗樣抖動，伴有或不伴有面部抽動記2分; 出現一側前肢震顫記3分; 站立、雙前肢震顫及持續性點頭記4分; 雙前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現全身性強直一陣攣性發作記5分; 發作衰竭導致死亡記6分[8]。各組大鼠給予視頻錄像監測，連續觀測30 d，統計1 d、3 d、7 d、14 d的動物行為并評分記錄。

1.3.2 腦電圖觀察 在模型動物大腦植入電極接入刺激裝置，參考電極放置右耳，連接于生理記錄儀。杏仁核快點燃模型制備完成，大鼠休息1星期時，開始刺激大鼠，分別記錄大鼠點燃前正常腦電，后放電腦電及點燃后4級以上發作腦電；快慢杏仁核點燃模型，均按此記錄腦電；匹羅卡品組制備前、后1 h記錄動物的腦電變化，每組大鼠接受處理前后各描記腦電圖1 h，首先連續記錄15 min，然后每隔5 min 記錄10 min，1 h 內完成。腦電圖資料用隨機軟件計算出癇樣放電潛伏期、頻率和波幅。根據Racine 分級，4級以上發作，腦電圖在尖波或棘波的基礎上出現陣發性或持續性異常放電為模型成功，以成功率表示。

1.4 統計處理

應用SPSS 13.0軟件分析數據，計量資料間的比較采用t檢驗，各組之間兩兩比較用LSD 檢驗，各組成功率兩兩比較用χ2檢驗，檢驗水準取α= 0.05。

2 結果

2.1 動物模型結果

慢點燃組20只大鼠，電極掉落3只，麻醉死亡2只，點燃10只， 未點燃5只，平均點燃周期20 d；快點燃組20只大鼠，電極掉落5只，麻醉死亡1只，未點燃2只，點燃12只，平均點燃周期5 d；匹羅卡品組20只大鼠，17只當天3～5級發作，1只死亡，2只未點燃，1周后死亡2只，有自發性癲癇的有15只(有自發性點燃確定為點燃)，各組癲癇模型點燃率的比較見表1，匹羅卡品組的點燃率明顯高于其它兩組(P<0.05)。

表1 3種方法癲癇模型點燃率比較Tab.1 Comparison of epilepsy burning rates among the three methods

(1)與匹羅卡品組比較，P<0.05

2.2 行為學觀察

各組癲癇發作級別及行為評分結果見表2、表3所示，第1天慢3組大鼠行為評分結果與未點燃組比較差異有統計學意義，快點燃組評分明顯高于其它各組(P<0.05)，提示3種方法均能獲得成功；快點燃獲得模型的時間較短，癲癇行為比較典型，但是隨著時間的推移，癲癇行為的表現會逐漸降低，而慢點燃組第14天時癲癇行為比其它各組明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠癲癇點燃成功時癲癇發作情況Tab.2 Epileptic seizure conditions of rats when burning successfully in the three groups

表3 3各組大鼠Racinel行為評分Tab.3 Racinel behavior scores of rats in the three groups

(1)與同時期未點燃組比較，P<0.05；(2)與同時期快點燃組比較，P<0.05；(3)與同時期慢點燃組比較，P<0.05

2.3 腦電圖觀察

慢點燃組、快點燃組、匹羅卡品組腦電圖監測異常率分別為95%、95%、94%，所有有行為學異常表現的大鼠腦電圖上均有異常表現，各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為大鼠正常腦電圖， B為杏仁核點燃大鼠癲癇發作時后放電腦電圖， C為5級癲癇大發作時腦電圖，D為匹羅卡品組大鼠癲癇發作時腦電圖

3 討論

癲癇是一種以大腦局部病灶突發性的異常高頻放電并向周圍組織擴散為特征的大腦功能障礙，可伴有明顯腦電圖改變，可能伴隨著短暫性的運動、感覺、意識及自主神經功能異常，癲癇模型在癲癇的病理生理研究和抗癲癇藥物的研究中發揮著重要的作用[9]。

較理想的癲癇模型應具有和人類癲癇相似的發生、發展過程，才能用于相關實驗研究，獲得的研究數據才具有臨床參考價值[10]。目前較為公認的癲癇動物模型至少應具備以下幾種特點：首先具有諸如神經細胞丟失、膠質細胞增生、軸突絲狀芽生和突觸重建等與人類癲癇相似的病理學基礎，其二是在初始刺激與自發性癲癇發作之間有較為固定的潛伏期( 維持數天至數周)；其三是所獲得的動物模型在一定時間內保持大腦神經元興奮性持續增高[11-15]。

本研究用不同的方法制備癲癇模型，杏仁核是癲癇模型點燃最敏感的區域[16]。本實驗在相同條件下檢測癲癇模型的特點，比以往研究中觀察單一模型的臨床特點有了一定的進步，同時，本實驗結合腦電圖檢測，使獲得的模型及分析結果更具有客觀性，排除主觀因素的影響[17-20]。快點燃和慢點燃的區別主要在于刺激參數的設置及刺激間隔時間的長短，通過大量查閱文獻及實驗摸索找到了較準確的刺激參數。杏仁核慢點燃動物模型的癲癇行為學表現時間最長，模型穩定性好，模型點燃后自發性強，并且能最大限度的接近人類癲癇發作時腦電的特征，適合于臨床耐藥性、臨床藥物的篩選或者用藥劑量的研究；而快點燃模型動物出現癲癇行為較早，可用于外傷或者急性毒性藥物的研究；匹羅卡品組動物損傷較小，動物存活時間長，可以用于神經性藥物或急性藥物對癲癇影響的研究。3種模型的同時制作和對比，能更好的幫助模擬人類癲癇發作時的發作狀態及發病后大腦腦電的改變，也為往后更深入的實驗提供了基礎支持。

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(2015-02-12收稿，2015-04-03修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 趙 毅

Analysis of Preparation and Application of 3 Epilepsy Models

CHEN Zhongwei, ZHOU Xin， WANG Likun， WU Guofeng

(AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the preparation of different epilepsy models and its application in epilepsy research. Methods: Sixty adult male SD rats were randomly divided into amygdala kindling slow group, amygdala kindling fast group, and pilocarpine injection group with 20 rats in each. Observing seizure grade of epilepsy rats and epileptic behavior Racinel scores, and EEG of rats during seizure. Results: Various epilepsy animal models were successfully obtained, Racinel scores were significantly different among each group (P<0.05). In which, epilepsy of slowly burning animals continued for a longer time, quick burning group showed typical epileptic seizure behavior earlier, and the pilocarpine animals lived longer time. Conclusion: The pilocarpine injection group showed higher success rate and epilepsy behavior lasted longer, which can better serve clinical purpose. However, pilocarpine triggered epileptic seizure time varies greatly, which might cause certain inconvenience for clinical screening.

epilepsy; disease models, animal; pilocarpine; rats, Sprague-Dawley

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1313.030.html

R742.1

A

1000-2707(2015)05-0482-04