正交試驗優化桃仁油中脂肪酸類分離純化工藝*

劉 清 顏永剛 王紅艷 衛 昊

陜西中醫藥大學(咸陽 712046)

·方藥縱橫·

正交試驗優化桃仁油中脂肪酸類分離純化工藝*

劉 清 顏永剛△王紅艷 衛 昊

陜西中醫藥大學(咸陽 712046)

目的: 篩選桃仁油中脂肪酸類化學成分分離純化的最佳工藝。方法: 以UV法測定桃仁油中脂肪酸類成分含量為指標,選用不同的填料LS-106大孔樹脂和硅膠，不同柱徑比，不同樣品濃度、不同洗脫速度對桃仁油中脂肪酸類化學成分得率的影響， 洗脫劑石油醚：丙酮比例依次為85∶15，87.5∶12.5，90∶10。用正交試驗設計法對純化工藝進行分析。結果: 本實驗以桃仁脂肪酸含量作為篩選填料的評價指標，比較了三種因素影響下LS-106大孔樹脂及硅膠對桃仁脂肪酸的分離純化性能，硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，用A3B3C2條件作為桃仁脂肪酸的最佳分離純化工藝。結論: 驗證試驗結果表明該方法具有可操作性、準確、簡便、靈敏、穩定性強、重現性好。硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，在A3B3C2條件下用于桃仁油中脂肪酸類物質的分離純化。

桃仁來源于薔薇科(Rosaceae)植物桃Prunuspersica(L)Batsch.或山桃Prunusdaridiana(Carr.)Franch.的干燥成熟種子，性味苦、甘，平，具有活血化瘀、潤腸通便的功效,用于經閉，痛經，癥瘕痞塊，跌撲損傷，腸燥便秘[1-2]。在血府逐瘀湯(《醫林改錯》)、生化湯(《傅青主女科》)、桂枝茯苓丸(《金匱要略》)、桃核承氣湯(《傷寒論》)等醫家名方中均重用桃仁，現代研究亦表明桃仁對心腦血管疾病療效顯著，近年來受到廣泛關注[3]。在前期工作的基礎上，本實驗采用LS-106樹脂及硅膠對桃仁油中的脂肪酸類成分進行純化，以便得到純度高的組分，為進一步篩選桃仁活血化瘀的活性組分提供了藥效研究的物質基礎。

1 儀器與試藥 UV-2500紫外可見分光光度儀(上海天美科學儀器有限公司)，GB204型電子天平(德國賽多利斯公司),LS-106大孔吸附樹脂、柱層析硅膠(200-300目)，亞油酸標準品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號111622-200602,)，95%乙醇、石油醚(600C-900C)、甲醇、丙酮、無水乙醇、硫酸、香草醛等均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果 2.1 標準曲線的制定 取亞油酸標準品進行紫外掃描，確定最大波長為269nm。精密稱取亞油酸對照品50μL,用甲醇溶解并定容至50mL，濃度為1.16mg/mL,分別精確取1、2、3、4、5mL置10mL容量瓶中,甲醇定容。采用紫外分光光度法，以吸光度A對濃度C做標準曲線,得回歸方程為C=1.66174A～0.12370,r=0.9996。

2.2 純化試驗設計 本實驗以桃仁油中脂肪酸類含量為指標,考察不同柱徑比，樣品濃度、洗脫速度對桃仁得率的影響， 洗脫劑石油醚：丙酮比例依次為85∶15，87.5∶12.5，90∶10。用正交試驗設計法對純化工藝進行分析,因素水平見表1。

表1 純化工藝因素水平表

2.3 樣品液中亞油酸的含量測定 2.3.1 上樣液的制備：取桃仁油3mL,分別將1mL定容至5mL，1mL定容至10mL，1mL定容至15mL，制成濃度0.2mL/mL、0.1mL/mL、0.067mL/mL，作為上樣液。

2.3.2 柱層析分離：將各樣品液加到已處理好的大孔吸附樹脂柱中,靜置30min后,依次用石油醚與丙酮800mL(85∶15，87.5∶12.5，90∶10)梯度洗脫,選擇洗脫液流速、每50mL為1份,分段收集,得到大孔吸附樹脂分離樣品。同法用硅膠作為層析柱填料，在相同條件下洗脫得到硅膠分離樣品。

2.3.3 點樣結果分析：用毛細管分別吸取減壓濃縮后純度較高的桃仁油溶液和亞油酸標準品各5μL在硅膠G薄層上點樣，展開劑為石油醚-丙酮體系(85∶15至90∶10)，用5%香草醛-硫酸乙醇溶液在105℃條件下顯色，測定Rf值。合并洗脫液，水浴揮干洗脫溶劑，得到純度較高的桃仁油，用甲醇定容至10mL,按照標準曲線法測定各個樣品中亞油酸的含量。

2.4 純化實驗結果 硅膠純化樣品相對含量結果見表2，大孔吸附樹脂純化樣品相對含量結果見表3，兩種固定相不同梯度洗脫所測各有效組分相對百分含量結果見表4、5。硅膠純化工藝顯示，徑柱比和樣品濃度對有效成分含量具顯著性影響，流速影響不大。大孔吸附樹脂純化工藝顯示，徑柱比和樣品濃度對有效成分含量具顯著性影響，流速影響不大。試驗因素的主次順序為柱徑比>樣品濃度>流速,最優水平為A3B3C2。方差分析說明柱徑比對試驗影響差異達到顯著水平。對三個洗脫梯度進行比較可以看出石油醚：丙酮(85∶15)有效組分相對百分含量較高。

表2 硅膠純化工藝正交實驗方案和結果

表3 大孔吸附樹脂純化工藝正交實驗方案和結果

表4 硅膠不同梯度洗脫所測含量

表5 大孔吸附樹脂不同梯度洗脫所測含量(%，n=9)

2.5 驗證試驗 精確取桃仁油1mL,定容至15mL制成樣品液,經薄層鑒定后合并的樣品揮干溶劑,用甲醇定容至10mL,按上述方法測定亞油酸的含量。根據A3B3C2,石油醚：丙酮在(85∶15至90∶10)的條件做平行實驗。結果脂肪酸含量用樹脂柱純化或者用硅膠柱純化，其含量均在95%以上，表明該方法可操作性強、重現性好。其中以硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，優選在A3B3C2條件下進行桃仁脂肪酸的純化。

2.6 桃仁油中脂肪酸類的分離純化 由于大量粗桃仁油樣品通過樹脂柱時玻璃柱出現爆裂，分析原因可能是由于溶劑極性差異較大，在樹脂柱內產生放熱過程，因此用硅膠柱對桃仁油進行純化分離。利用正交試驗所確定的實驗結果大量提取粗桃仁油100mL，分兩次進行純化分離，50mL桃仁油用石油醚稀釋到125mL，層析柱用200～300目的層析硅膠干法填柱，柱徑比為1∶12，用石油醚浸透硅膠，將上樣液緩緩加入硅膠柱，流動相用石油醚與丙酮梯度洗脫，石油醚：丙酮比例為99∶1至50∶50，每2.5個單位等度遞減，進行洗脫，濃縮不同的洗脫液，通過薄層色譜鑒定，合并洗脫液，得到純度較高的桃仁油。

3 討 論 桃仁在提取、分離時避免溫度過高，否則會破壞藥材的部分化學成分。用非極性溶劑石油醚萃取時，盡量萃取完全，否則桃仁脂肪酸的產率將會降低。桃仁提取物在柱層析分離過程中，層析柱分離樣品的量和填料的量都要明確，填料后要考慮柱徑比，以保證樣品有良好的分離效果。梯度洗脫過程中樣品餾分的范圍要小，薄層分析檢測后要準確、及時的合并樣品，并做好標記和記錄。本實驗以桃仁脂肪酸含量作為篩選填料的評價指標，比較了三種因素影響下LS-106大孔樹脂及硅膠對桃仁脂肪酸的分離純化性能，硅膠作為固定相所得有效組分含量較高，故優選A3B3C2條件作為桃仁脂肪酸的純化工藝。

[1] 中國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:化學工業出版社，2010:260.

[2] 張廷模．中藥學[M]．高等教育出版社，2002．265．

[3] 裴 瑾，顏永剛,萬德光.桃仁油對動物血液流變學及微循環的影響[J].中成藥,2011,33(4):587-589.

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

*國家自然科學基金(30901970)

桃仁 正交試驗 脂肪酸類 @分離純化

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.049

陜西省教育廳專項科研計劃項目(14JK1204)

△通訊作者