馬連草中藥制劑對潰瘍性結腸炎的作用機制*

張 瑜 董 蕾

西安交通大學第二附屬醫院消化內科(西安 710004)

馬連草中藥制劑對潰瘍性結腸炎的作用機制*

張 瑜 董 蕾△

西安交通大學第二附屬醫院消化內科(西安 710004)

目的：建立三硝基苯磺酸(TNBS) 誘導的潰瘍性結腸炎大鼠模型，觀察馬連草制劑對潰瘍性結腸炎大鼠的治療作用，并探討其機制。方法：將60只SD大鼠用5%三硝基苯磺酸溶液(100mg/kg)、50%乙醇溶液0.25mL灌腸1次建立潰瘍性結腸炎模型，造模成功后隨機分為模型組，柳氮磺吡啶組，馬連草制劑高、中、低劑量組，地塞米松組，每組10只，并另取10只未造模大鼠作為正常對照組。除正常組和模型組外，其余各組從第2天開始用相應藥物治療，9d后處死動物，觀察結腸大體形態和組織學改變，ELISA法測定大鼠血清TNF-α含量，并檢測腸黏膜髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。結果：模型組較正常組體重明顯下降，結腸大體形態，組織學損傷評分升高，血清TNF-α含量，結腸組織中MPO活性、MDA含量比正常組升高，SOD活性比正常組下降,經灌腸后各治療組均可不同程度逆轉這些變化，馬連草制劑高劑量組優于其他治療組。結論：馬連草制劑能夠有效治療TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎，高劑量組治療效果優于中、低劑量組，減輕細胞因子損傷，促進氧自由基清除,減輕脂質過氧化損傷，調節機體免疫是其治療潰瘍性結腸炎的可能機制。

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病。其病因和發病機制尚不清楚。近年來中醫藥治療本病積累了豐富的經驗，尤其是中藥灌腸治療具有使藥物直達病所、保證藥物作用濃度、保護腸道潰瘍面，不良反應少等特點，具有積極的臨床意義[1]。我們自擬了包含馬齒莧、黃連、甘草、三七四種中藥的馬連草制劑，通過本實驗研究了該制劑對三硝基苯磺酸所誘導的潰瘍性結腸炎大鼠模型的治療作用，并探討相關的作用機制。

1 材料和方法 1.1 動 物 雄性SD大鼠70只，體重200～250g，SPF級，購買并飼養于西安交通大學動物實驗中心。

1.2 藥 物 馬連草制劑是由馬齒莧60g，黃連20g，甘草20g，三七粉12g組成的中藥復方。生藥由西安交通大學第二附屬醫院中藥房提供，將藥物洗凈，浸泡1h，加水文火煎煮兩次，第1次30min(以沸騰開始計算)，第2次40min，合并煎液，濾過，95℃水浴濃縮，使每毫升含生藥1.12g。藥物制成后，高壓滅菌消毒分裝，4℃冰箱保存備用。磺胺吡啶(SPSA)為上海三維制藥有限公司生產，將片劑去糖衣研細，用時加蒸餾水配成0. 1 g/mL的混懸液。地塞米松為山西晉新雙鶴藥業有限公司生產，用時加生理鹽水配制成0.18mg/mL的溶液。5%2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)為美國Sigma公司產品，批號P2297. TNF-αELISA試劑盒為美國BenderMedSystems產品，超氧化物歧化酶(SOD)測試盒,髓過氧化物酶(MPO)測試盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒，BCA法蛋白定量試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法 2.1 建立動物模型 60只大鼠禁食不禁飲24h，用4%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(300mg/kg)后，將直徑2mm的硅膠管插入大鼠結腸至距肛門約8cm處，緩慢注入相應體重比例的5%三硝基苯磺酸溶液(100mg/kg)、50%乙醇溶液0.25mL[2]，然后再注入一段長約0.3mL的空氣，倒拎大鼠1min，造模后歸籠，自由飲食，每天記錄體重、觀察精神、皮毛、大便、活動、飲食、存活等情況[3]。

2.2 動物分組 造模后60只大鼠隨機分為模型組，柳氮磺吡啶組，馬連草制劑高、中、低劑量組，地塞米松組，每組10只，另10只未造模大鼠作為空白對照組(正常組)。

2.3 給 藥 從造模第2天起，除正常組、模型組外，其余各組開始灌腸治療。SASP組:SASP混懸液灌腸，按0. 4g/kg劑量。馬連草制劑高、中、低劑量組分別按10g、5g、2.5g生藥每公斤體重的劑量灌腸，相當于成人用量的6.4、3.2、1.6倍。地塞米松組：地塞米松溶液灌腸，按0.9mg/kg劑量。各組每日給藥一次，連續給藥9d。

2.4 動物處理及病理切片制作 至造模后第10天，腹主動脈抽血處死各組動物，取肛門至回盲部結腸，沿腸系膜縱行剖開，冰生理鹽水反復沖洗，除去血液，濾紙拭干，觀察大體形態改變，每段結腸自距肛門1cm、4cm、8cm處取3塊組織標本(3mm×10mm)，另于炎癥嚴重或潰瘍處至少取1塊組織，用4%甲醛液固定，常規石蠟包埋，切片(5μm)，HE染色，觀察組織學改變。形態及組織學改變分別參照王皓等提出的評分標準進行評分。其余結腸組織快速放液氮中速凍，轉入-70℃低溫冰箱保存，用于檢測MPO、SOD、MDA水平。造模后因病變嚴重而自行死亡的大鼠，結腸組織也均按上述方法處理。

2.5 檢測指標與方法 MPO、SOD、MDA水平測定 將凍存的結腸解凍，稱取遠端結腸組織約1g，放入試管，再加9倍體積冰冷PBS緩沖液(pH7.4)冰浴勻漿，4℃下2000r/min離心10min，取上清液。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；硫代巴比妥酸比色法(TBA)測定MDA含量；采用普通生化方法測定MPO含量。具體操作按試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所提供)進行。血清TNF-α含量測定 大鼠腹主動脈無菌抽血，4℃靜置過夜，3000 r/min離心20 min，取上清，分裝，置于-20℃冰箱保存待測，使用ELISA試劑盒，按照說明書，測定大鼠血清TNF-α含量。

2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件處理,所有數據均用均數±標準差表示，采用單因素方差分析比較各組數據間的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結 果 3.1 大便性狀、體重改變及存活情況 各組大鼠造模后，14～24h后均出現腹瀉，表現為黃色稀便、水樣便、黏液便，或肛周體毛被稀便沾染，少數排膿血便，咖啡色稀水便，甚至肛周尾部嚴重脫毛，此外還出現精神萎靡，易激惹，活動量及攝食量減少等癥狀。各治療組治療后大便均在2～5d內恢復正常，其他癥狀也得到不同程度的改善，而模型組腹瀉及其他癥狀可持續1周以上。正常組大鼠在10d內平均體重增加99.50g±16.12g，模型組和各治療組造模后體重均下降，模型組體重下降可持續7～8d以上甚至整個觀察時間，10d內平均體重增加-32.21g±13.10g，顯著低于正常組及各治療組(P<0.01)，各治療組灌腸2-5后即出現體重回升，馬連草制劑高劑量組10d內體重平均增加71.40g±15.26g，顯著高于其他治療組(P<0.01)，馬連草制劑中、低劑量組平均體重增加42.40g±14.86g，21.89g±12.35g，柳氮磺吡啶組29.78g±12.86g，地塞米松組30.33g±12.80g，這4組體重增加無明顯統計學差異(P>0.05)。模型組大鼠造模后死亡3只，死亡率30%；正常組、馬連草制劑高、中劑量組無死亡；柳氮磺吡啶組、地塞米松組、馬連草制劑低劑量組各死亡1只，死亡率均為10%。

3.2 大體形態、組織學損傷 模型組死亡大鼠解剖尸體可見結腸組織發黑壞死，壞死范圍4～6cm，腸腔明顯擴張，其中一只出現腸穿孔，一只并發腸梗阻，3只均有腸壁與脾臟粘連難以分開，少量腹水形成。其余7只均有結腸與周圍組織不同程度的粘連，結腸標本表現為黏膜水腫，紅斑，潰瘍形成，炎癥和潰瘍位于距肛門8cm范圍內，潰瘍呈白色線狀或灶性，周圍黏膜增厚,腸壁損傷部位有假膜樣物覆蓋。各治療組治療后結腸病變肉眼觀察均有不同程度的改善。光鏡下模型組表現為黏膜上皮細胞脫落、糜爛和潰瘍形成，腸腺萎縮甚至消失，密度減低，杯狀細胞減少，炎癥存在于黏膜和黏膜下層，少數可達肌層，可見炎癥細胞浸潤，主要為中性粒細胞，還有數量不等的巨噬細胞和嗜酸性粒細胞，潰瘍周圍可見隱窩變形。治療后結腸黏膜得到修復，偶見較小的潰瘍面存在，黏膜及黏膜下層可見淋巴細胞和漿細胞浸潤，結締組織增生并纖維化，黏膜下小血管增生，見表1，圖1。

表1 結腸大體形態，組織學損傷評分

注：與正常組比較，△P<0.01,▲P<0.05；與模型組比較，□P<0.01

A正常組B模型組C馬連草制劑高劑量組D馬連草制劑中劑量組E馬連草制劑低劑量組F柳氮磺吡啶組G地塞米松組

圖1 大體形態及病理切片表現(HE×100)

3.3 各組大鼠血清TNF-α含量 模型組大鼠血清TNF-α含量比正常組均顯著升高(P<0.01),而各治療組大鼠血清TNF-α含量均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組TNF-α含量接近甚至低于正常水平(P>0.05),明顯低于其他治療組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清TNF-α含量

3.4 各組大鼠結腸組織中MPO、SOD活性及MDA含量 模型組大鼠結腸組織中MPO活性比正常組顯著升高(P<0.01)，而各治療組大鼠結腸組織中MPO活性均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組MPO活性降至接近正常組水平(P>0.05)，低于其他治療組(P<0.05)。模型組大鼠結腸組織中SOD活性比正常組顯著下降(P<0.01)，而各治療組大鼠結腸組織中SOD活性均較模型組顯著上升(P<0.01)，馬連草高劑量組和地塞米松組SOD活性升至接近正常組水平(P>0.05)模型組大鼠結腸組織中MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)，而各治療組大鼠結腸組織中MDA含量均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組MDA含量接近甚至低于正常組(P>0.05)，見表3。

表3 大鼠結腸組織中MPO、SOD活性及MDA含量

4 討 論 本實驗研究結果表明，三硝基苯磺酸所誘導的大鼠潰瘍性結腸炎出現腹瀉，體重下降，精神萎靡，攝食量及活動量減少甚至死亡等癥狀，遠端結腸黏膜充血、水腫，潰瘍形成，病變呈連續性分布，光鏡下表現為黏膜上皮細胞脫落、糜爛和潰瘍形成，腺體密度降低甚至消失，杯狀細胞減少，炎癥多存在于黏膜和黏膜下層，少數可達肌層，可見多種炎癥細胞浸潤。結腸組織中，可作為中性粒細胞特異性標記物的MPO活性顯著升高，脂質過氧化終末產物MDA的含量顯著增加，SOD活性顯著下降。血清中致炎性細胞因子TNF-α的含量顯著上升。

中藥復方馬連草制劑治療后，腹瀉、體重下降等癥狀好轉，死亡率下降，結腸黏膜充血、水腫、潰瘍得到明顯的改善和修復，結腸組織中升高的MPO活性下降，MDA含量回降，而降低的SOD活性重新升高，血清中炎性細胞因子TNF-α的含量顯著降低，并且高劑量組的效果最為顯著，各項觀察指標接近正常組水平，優于中、低劑量組和柳氮磺吡啶組、地塞米松組。可見，馬連草制劑對三硝基苯磺酸所誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型有治療作用，并且受劑量的影響，劑量越大，治療作用越好。現代藥理研究表明，馬齒莧有抗菌抗病毒、增強免疫、抗衰老等作用。馬齒莧含有豐富的維生素E、谷胱甘肽等營養性抗氧化劑，減少或消除自由基和過氧化脂質對機體損傷，起到抗衰老的作用[4]。甘草具有清熱解毒、止渴祛痰、補脾和胃、調和諸藥等功效。據報道甘草明顯降低結腸黏膜黏連及其潰瘍分值和脾臟指數，其免疫調解機制可能是作用于抑制性巨嗜細胞，放大免疫細胞的生物學效應，進而起到調節抗體產生細胞活性的作用[5-7]。黃連性寒、味苦，從黃連中提取的生物堿黃連素具有抗菌、抗潰瘍、調節免疫等藥理功能[8]。三七可顯著清除氧化自由基損傷，清除主要致炎癥因子，是其治療潰瘍性結腸炎的主要作用機制之一。

綜上所述，從現代藥理學角度看，馬連草制劑中馬齒莧、甘草、黃連、三七均具有增強免疫力，抗衰老，抗菌抗病毒，抗潰瘍等作用[9]。從傳統中藥配伍來看，該制劑配伍合理，結構嚴謹，是治療潰瘍性結腸炎的有效復方制劑。總而言之，我們猜想馬連草制劑通過提高機體免疫功能，調控各種炎癥因子的表達，清除氧化自由基損傷等多個方面發揮治療作用，其進一步的治療機制還需要更加深入的研究。

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(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

*“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2012BAJ18B03-03)

結腸炎，潰瘍性/中醫藥療法 動物，實驗 大鼠

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.056

△通訊作者