根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)VirE2-N-EGFP在2種茄科植物中的表達(dá)分析

杜利娟，薛 楊，張 旺，孫現(xiàn)超*　(.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 40076；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 4007)

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根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)VirE2-N-EGFP在2種茄科植物中的表達(dá)分析

杜利娟1，薛 楊2，張 旺1，孫現(xiàn)超1*(1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712)

摘要為了明確根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源蛋白在茄科植物葉片細(xì)胞中能否瞬時(shí)表達(dá)，克隆了土壤根癌農(nóng)桿菌的VirE2基因，并融合至綠色熒光蛋白(EGFP)的 N端，成功構(gòu)建pPZP-VirE2-N-EGFP植物表達(dá)載體。以茄科的本氏煙為對(duì)照，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)在辣椒和番茄葉片細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)分析。用共同聚焦顯微鏡可以在本氏煙和辣椒葉片細(xì)胞中觀察到綠色熒光，而在番茄葉片細(xì)胞中未觀察到。表明外源蛋白VirE2-N-EGFP可以在辣椒葉片細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究辣椒中與植物病原互作基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞根癌農(nóng)桿菌；VirE2-N-EGFP；茄科植物；表達(dá)

Expression Analysis of VirE2-N-EGFP Mediated byAgrobacteriumin Two Solanaceae Plants

DU Li-juan1, XUE Yang2, ZHANG Wang1, SUN Xian-chao1*(1. College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716; 2. Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

AbstractIn order to make it clear that whether heterologous protein could be transiently expressed in Solanaceae plants, we cloned the VirE2 gene from agrobacterium by PCR, fused it to the N terminal of EGFP and successfully constructed the plant expression vector pPZP-VirE2-N-EGFP. VirE2-N-EGFP was expressed in the leaf cells ofCapsicumannuumandLycopersiconesculentumMill mediated by agrobacterium, with the Nicotiana benthamiana as control. Green fluorescence was observed in the leaf cells ofNicotianabenthamianaandCapsicumannuum, but not in that ofLycopersiconesculentumMill. The results indicated that the heterologous protein VirE2-N-EGFP could be successfully expressed in the leaf cells ofCapsicumannuum, which provide a basis for research on the function of the pathogeny interacted protein inCapsicumannuum.

Key wordsAgrobacterium; VirE2-N-EGFPl; Solanaceae plants; Expression

在研究植物基因功能時(shí)，通常采用異源表達(dá)植物基因編碼蛋白與熒光蛋白的融合蛋白方法，來(lái)分析該基因編碼蛋白的功能或細(xì)胞定位。目前研究多是在煙草尤其是本氏煙或擬南芥中瞬時(shí)表達(dá)融合蛋白。而在有些情況下植物基因異源表達(dá)不能準(zhǔn)確展示其真實(shí)功能，影響人對(duì)基因功能的正確理解。

隨著功能基因組研究的逐漸深入，許多植物的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，對(duì)基因組中潛在功能基因的挖掘和利用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。茄科植物很多與人們生活密切相關(guān)，對(duì)其基因組編碼蛋白功能的準(zhǔn)確詮譯具有重要意義。VirE2是根癌土壤桿菌株C58Ti 質(zhì)粒中vir 區(qū)的一個(gè)毒性蛋白[1]，其核靶向運(yùn)輸在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中起到非常關(guān)鍵的作用[2]。Dumas等[3]研究表明3VirE2 在磷脂雙分子層內(nèi)可以形成一個(gè)膜通道，該通道是單鏈DNA 的特異性通道，有助于單鏈DNA 有效的跨膜運(yùn)輸，保證外源DNA 能順利進(jìn)入到植物細(xì)胞質(zhì)中。為了更好地在茄科作物中瞬時(shí)表達(dá)其自身編碼蛋白，筆者克隆了土壤根癌農(nóng)桿菌的VirE2，分析了其在茄科煙草、辣椒和番茄3種作物葉片中的瞬時(shí)表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒。供試大腸桿菌DH5α由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院保存。根癌土壤桿菌株C58、植物表達(dá)載體pPZP-RCS1和中間載體pSAT1-N-EGFP由美國(guó)紐約州立大學(xué)石溪分校Vitaly教授贈(zèng)送。本氏煙、番茄和辣椒種子由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院保存，在溫室育苗盆中播種，培養(yǎng)至4~6葉期備用。

1.1.2試劑和引物。高保真ExTaqTMDNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。

根據(jù)U.Washington 發(fā)表的根癌土壤農(nóng)桿菌C58基因全序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由華大基因公司合成，其正向引物基因序列VirE2 F：5′-GAGAATTCATGGATCCGAAGGCCGA-3′；反向引物VirE2 R：5′-CAGCCCGGGGTGACGCGGTATCAGGAA-3′。

1.2方法

1.2.1土壤根癌農(nóng)桿菌C58質(zhì)粒的提取。參照農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒堿法小量提取方法[4]，提取并純化C58質(zhì)粒，用TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2VirE2 基因克隆。以獲得的質(zhì)粒為模板，VirE2 F和VirE2 R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μl)：10 × PCR buffer 5 μl，dNTP(2.5 mmol)2 μl，MgCl2(2.5 mmol)4 μl，引物(3 μmol)各2 μl，模板1 μl(約5 ng)，去離子水34 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)劉紅玲等[4]構(gòu)建的融合蛋白植物表達(dá)載體構(gòu)建系統(tǒng)，將克隆基因用EcoR I和SmaI進(jìn)行酶切，連接到相應(yīng)酶切過(guò)的pSAT1-N-EGFP中間載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有100 mg/L Ampicilin的LB平板培養(yǎng)，挑取菌落，并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，選取3個(gè)克隆送華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證。在成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒上，用AscI酶切下表達(dá)盒，連接到經(jīng)同樣酶切過(guò)并去磷酸化的pPZP-RCS1載體上，在含有500 mg/L 壯觀霉素的LB平板培養(yǎng)，PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆，并再次酶切鑒定。

1.2.4根癌土壤桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。從-80 ℃冰箱取出保存的EHA105菌株，劃平板過(guò)夜，挑選單菌落接種于無(wú)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中搖菌12~16 h，CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。參考Liu等[5]方法將pPZP-VirE2-N-EGFP以熱擊法轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。取2份100 μl EHA105感受態(tài)細(xì)胞分別加入5 μl pPZP-VirE2-N-EGFP、空載體的質(zhì)粒pPZP-RCS1(對(duì)照)，冰浴30 min，然后液氮速凍5 min，37 ℃水浴鍋浸浴5 min，迅速冰浴2 min，加入1 ml無(wú)抗YEP液體培養(yǎng)基，28 ℃輕搖4~6 h。離心棄400 μl上清，其余均勻涂布于含有壯觀霉素的YEP固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至少2 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。菌落PCR擴(kuò)增鑒定。將擴(kuò)增出目的基因片段的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，與25%甘油按1∶1置-80 ℃保存。

1.2.5pzp-EGFP-N-VirE2在本氏煙、辣椒和番茄的瞬時(shí)表達(dá)和檢測(cè)。參考Li等[6]方法，采用根癌土壤桿菌滲入法將含pzp-EGFP-N-VirE2的根癌土壤桿菌EHA105分別注射到四葉期本氏煙和茄科作物辣椒、番茄葉片中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(白天27 ℃光照16 h，晚上22 ℃黑暗8 h)，3 d后分別取不同處理注射口附近的葉片部分，制作玻片，用共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)本氏煙和辣椒、番茄葉片中pzp-EGFP-N-VirE2是否能瞬時(shí)表達(dá)。以健康的本氏煙和辣椒、番茄葉片為空白對(duì)照，以注射帶有空載體的根癌土壤桿菌的葉片為陰性對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1根癌土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒毒性區(qū)蛋白VirE2基因的克隆以VirE2 F和VirE2 R為引物從土壤根癌農(nóng)桿菌C58 Ti質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增的目的片段，經(jīng)1%葡聚糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶約為1 700 bp，與預(yù)期VirE2基因1690大小基本一致(圖1)。

2.2VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表達(dá)載體的構(gòu)建將VirE2用PCR產(chǎn)物回收試劑盒割膠回收后，用EcoR I和SmaI酶切，再次割膠回收，連接到同樣酶切過(guò)的pSAT1-N-EGFP載體中，經(jīng)PCR鑒定篩選獲得陽(yáng)性克隆pSAT1-VirE2-N-EGF。測(cè)序驗(yàn)證表明VirE2基因大小1 668 bp，與目的基因100%同源，起始位置含有起始密碼在ATG，而末端不含終止密碼子。在EGFP N端與EGFP融合成一個(gè)基因VirE2-N-EGFP。在pSAT1-VirE2-N-EGF載體中VirE2-N-EGFP與上游含的2個(gè)35S啟動(dòng)子和末端的Nos終止子構(gòu)成一個(gè)4 000 bp左右的表達(dá)盒。表達(dá)盒兩端均有一個(gè)AscI酶切位點(diǎn)。用Asc I將表達(dá)盒切下，連接到植物表達(dá)載體pPZP-RCS1上，經(jīng)酶切鑒定表明，成功獲得VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表達(dá)載體pPZP- VirE2 -N- EGFP(圖2)。

2.3pzp-EGFP-N-VirE2在本氏煙、辣椒和番茄中的瞬時(shí)表達(dá)和檢測(cè)將pPZP-VirE2-N-EGFP轉(zhuǎn)化至根癌土壤桿菌EHA105，用同樣的方法注射本氏煙、辣椒和番茄葉片中，注射3 d后用共聚焦熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，pzp-EGFP-N-VirE2在根癌土壤桿菌的介導(dǎo)下在本氏煙和辣椒葉片中檢測(cè)到GFP，但在番茄葉片中沒(méi)有。表明用根癌土壤桿菌滲入法可以使VirE2-N-EGFP融合蛋白成功在本氏煙、辣椒中表達(dá)(圖2)，而在番茄葉片中未表達(dá)。

3討論

在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)外源基因已經(jīng)是一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)[7-10]，該研究中VirE2-GFP在本氏煙中也明顯表達(dá)，表明該試驗(yàn)過(guò)程是成功的。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因辣椒多有報(bào)道[11-12]，而在辣椒葉片中瞬時(shí)表達(dá)外源基因在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。利用轉(zhuǎn)基因來(lái)研究基因功能固然是有效的基因功能研究手段，但轉(zhuǎn)基因植物獲得需要時(shí)間明顯多于瞬時(shí)表達(dá)，因此在功能基因組時(shí)代大量鑒定基因功能仍需要瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)。該研究成功在辣椒中表達(dá)外源基因融合蛋白VirE2-GFP，對(duì)利用瞬時(shí)表達(dá)研究辣椒功能基因具有一定的參考價(jià)值。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系已成為成熟的技術(shù)體系[13-14]。Orzaez等[15]研究表明，從番茄花柱頂端注射農(nóng)桿菌滲入整個(gè)果實(shí)后，在果實(shí)中可檢測(cè)到瞬時(shí)表達(dá)的目的基因。牛顏冰等[16]利用馬鈴薯X病毒載體在番茄果實(shí)中成功表達(dá)了達(dá)胸腺素α1。張?jiān)蔓惖萚17]利用根癌農(nóng)桿菌注射方法成功地在番茄源葉和番茄果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)了轉(zhuǎn)化酶抑制子(inhibitors of invertases，INH)，并明確INH 主要在翻譯后水平調(diào)控轉(zhuǎn)化酶的活性。該試驗(yàn)未能在番茄葉片中檢測(cè)到VirE2-GFP融合蛋白的表達(dá)，其原因尚不明確。張大燕等[18]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)微小RNA在miRn51時(shí)發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)的不同品種對(duì)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)效率有一定影響。該試驗(yàn)也可能存在番茄品種差異導(dǎo)致根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因表達(dá)差異的原因。因此，需要用不同的番茄品種來(lái)進(jìn)一步分析明確。

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收稿日期2015-10-26

作者簡(jiǎn)介杜利娟(1989- )，女，河南焦作人，碩士研究生，研究方向：植物病害與病原互作。*通訊作者，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事植物病毒與病害生物防治研究。

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900937)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(XDJK2016A009，2362015xk04)；中國(guó)煙草總公司四川省公司科技項(xiàng)目(201202007)；中國(guó)煙草總公司湖南省公司科技項(xiàng)目(14-16ZDAa02)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)33-254-03