額爾敦—烏日勒對動脈粥樣硬化家兔血管內皮因子內皮素、血小板活化因子的影響

郝薔薇 麻春杰 烏蘭其其格 曾寒泊 萬宇 田海廣

正常的血管內皮細胞可調節血管緊張度，維持血管結構，并可分泌抗凝、抗血小板物質和纖溶蛋白，防止炎癥細胞向血管壁黏附聚集［1］。血管內皮細胞分泌的多種因子，是檢測動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊易損的重要指標。血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)和內皮素(endothelin，ET)是反映血管內皮功能的主要標志物。前期研究表明，額爾敦—烏日勒能夠有效干預動脈粥樣硬化的形成和發展［2-3］，促進eNOS基因的表達，增加其活性，升高內皮細胞生成的一氧化氮水平［4-5］，但額爾敦—烏日勒穩定AS家兔易損斑塊的作用機制與其對血管內皮因子PAF、ET的影響具有怎樣的聯系，國內外尚未有報道，故筆者團隊對此進行研究。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與藥物

50只健康雄性新西蘭家兔［由北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠提供，許可證號:SCXK(京)2011-0006］。額爾敦—烏日勒(內蒙古蒙藥股份有限公司，生產批號:120706;規格2 g/10粒);辛伐他汀(山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司，生產批號:20120703，國藥準字 H20083840，規格20 mg/片);青霉素鈉注射液(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020655，生產批號:20120716，規格160萬單位/瓶×50瓶/盒);肝素鈉注射液(天津生化藥業有限責任公司生產，國藥準字H12020505，生產批號:20121007，規格 1．25 萬單位/2 mL，2 mL/支，2 mL ×10 支/盒)。

1．2 試劑與儀器

PAF、ET的Elisa試劑盒由上海西塘生物科技有限公司提供(生產批號分別為F20412、F20030);PAF、ET-1一抗、二抗均由北京博奧森生物技術有限公司提供(一抗生產批號:bs-1119R，bs-0954R，二抗生產批號:SP-0023)。Thermo酶標儀(美國，型號:Multiskan Ascent)，DK-8D數顯恒溫水浴鍋(中國金壇，型號:DK-8D)，電熱恒溫培養箱(中國蘇州，型號:DNP9272)，高壓滅菌鍋(中國上海，型號:YXQLS-75SII)，生物顯微鏡和成像系統(中國南京，型號:BM2000型)，石蠟包埋機(德國，型號:EG1150H+C)，高速立式離心機(日本，型號:CF16RXii)

1．3 造模及分組

普通飼料喂養1周適應環境后，隨機分為正常組10只，造模組40只。造模組高脂飼料喂養4周，實驗第2周給造模組的家兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白生理鹽水溶液，4周后對造模的家兔進行球囊拉傷手術［6］。于實驗第8周通過檢測家兔血脂水平和主動脈病理形態學確定AS易損斑塊形成，證實造模成功，并將造模組最終存活的家兔(n=29)完全隨機分組，分為模型組(n=10)、額爾敦—烏日勒組(n=10)和辛伐他汀組(n=9)。

1．4 給藥方法及標本制備

正常組和模型組均灌服等容積的蒸餾水;額爾敦—烏日勒組按家兔體質量給予額爾敦—烏日勒0．4 g/(kg·d);辛伐他汀組按家兔體質量給予辛伐他汀5 mg/(kg·d)，各藥分別用蒸餾水制成混懸液喂飼。1次/天，至24周實驗結束。第24周末心臟采血，3000 rmp離心10分鐘分離血清;同時，隨機空氣栓塞處死每組家兔，迅速取出主動脈，生理鹽水清洗后，中性緩沖福爾馬林溶液固定。

1．5 實驗指標檢測

1．5．1 家兔血清 ET、PAF含量檢測 PAF、ET測定均采用酶聯免疫吸附(雙抗體夾心)法，根據試劑盒提供的試劑與實驗步驟要求進行操作，用Multiskan Ascent酶標儀完成測定。

1．5．2 家兔主動脈ET、PAF的表達 按照試劑說明書上步驟采用ABC法檢測，兩抗體均用抗體稀釋液稀釋200倍后使用，光鏡下觀測家兔主動脈血管內皮因子PAF、ET-1的表達。采用圖像分析系統對免疫組化染色切片半定量分析，每組隨機選取兩張切片，每張標本400倍鏡下選取5個不重復的視野，測量其陽性染色部位的平均光密度值(average optical density，AOD)，作為每張標本的的陽性定量指標。

1．6 統計學處理

采用SPSS 18．0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差±s)表示，若符合正態性分布和方差齊性，則采用單因素方差分析，兩組間的比較采用LSD檢驗;若不符合正態分布或方差齊性，則采用秩和檢驗，以P＜0．05或P＜0．01為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組家兔血清ET、PAF濃度

家兔血清ET符合正態分布，但方差不齊，進行秩和檢驗分析顯示，模型組家兔血清ET水平較正常組明顯升高(P＜0．01)，差異具有統計學意義;與模型組比較，額爾敦—烏日勒能明顯降低動脈粥樣硬化家兔ET水平(P＜0．01)，差異具有統計學意義。實驗家兔血清PAF數據不符合正態分布，進行秩和檢驗分析顯示，與正常組相比，模型組PAF濃度顯著升高(P＜0．01)，差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組相比，額爾敦—烏日勒能顯著降低血清PAF的濃度(P＜0．01)，差異具有統計學意義。見表1。

表1 各組家兔血清ET、PAF濃度的比較±s)

表1 各組家兔血清ET、PAF濃度的比較±s)

注:與正常組相比，a P＜0．01;與模型組相比，b P＜0．01;與辛伐他汀組比較，c P ＜0．01

分組 n ET(μg/L) PAFμg/mL)正常組9 158．55 ±16．64 23．58 ±1．48 10 117．02 ±16．69 19．17 ±2．13模型組 10 168．00 ±27．71a 29．33 ±3．89c額爾敦—烏日勒組 10 125．01 ±10．84bc 22．22 ±1．80b辛伐他汀組

2．2 各組家兔主動脈ET、PAF的表達

光鏡下可見主動脈血管ET、PAF胞漿內的棕黃色顆粒信號增強為陽性表現。光鏡下可見，ET在正常組血管內皮細胞中表達不明顯，模型組、額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組表達增強，呈棕黃色，與正常對照相比，模型組棕黃色顆粒表達強烈。免疫組化染色半定量分析染色切片中ET的AOD值符合正態性，方差齊，采用單因素方差及LSD比較。結果顯示，模型組家兔主動脈ET的AOD值比正常組明顯升高(P＜0．01)，差異具有統計學意義;與模型組相比，額爾敦—烏日勒組ET的AOD值顯著降低(P＜0．01)，差異具有統計學意義;與辛伐他汀組相比，額爾敦—烏日勒組ET的AOD值顯著降低(P＜0．05)，額爾敦—烏日勒組在降低主動脈血管內皮ET的表達上具有一定的優勢。見表2、圖1。

光鏡下觀測PAF染色切片結果顯示，與正常對照相比，模型組有強烈的棕黃色顆粒表達，陽性部位在內皮細胞的胞漿、胞膜及胞質里均可見。額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組兩組PAF陽性表達主要位于胞漿，胞膜僅有少量表達。染色切片中PAF的AOD值符合正態分布，方差齊，采用單因素方差分析及LSD比較。與正常組相比，模型組家兔主動脈血管PAF的AOD值與正常組相較明顯升高，(P＜0.01)，差異具有統計學意義，與模型組相比，額爾敦—烏日勒組主動脈PAF的AOD值顯著降低(P＜0．01)，差異具有顯著性。見表2、圖2。

表2 各組家兔主動脈ET、PAF免疫組化染色AOD值的比較(±s)

表2 各組家兔主動脈ET、PAF免疫組化染色AOD值的比較(±s)

注:與正常組相比，a P＜0．01;與模型組相比，b P＜0．01;與辛伐他汀組相比，c P ＜0．05。

10 0．0811 ±0．0138 0．0851 ±0．0021模型組 10 0．1605 ±0．0119a 0．1901 ±0．1735a額爾敦—烏日勒組 10 0．1060 ±0．0140bc 0．1327 ±0．0112b辛伐他汀組ET PAF正常組分組 n 9 0．1219 ±0．0158 0．1267 ±0．0138

圖1 各組家兔主動脈ET免疫組化檢測結果(×400)

圖2 各組家兔主動脈PAF免疫組化檢測結果(×400)

3 討論

動脈粥樣硬化的發生、發展與血管內皮功能密切相關，內皮細胞具有抗凝、止血、選擇性屏障、細胞通透性等作用，內皮細胞功能障礙可使血液中的脂質等成分堆積于內皮下間隙，從而形成泡沫細胞［7］。血管內皮功能減退是動脈粥樣硬化早期病變最敏感的指標，是AS的重要始動因素之一。內皮細胞損傷是誘發AS的重要環節，保護內皮細胞可有效防止AS的發生發展。ET是內皮細胞分泌的主要縮血管因子，維持血管張力，調節血管內皮功能，而 PAF是動脈粥樣硬化形成的關鍵起始因子［8］。

隨著民族醫藥的發展，蒙醫蒙藥在臨床上取得了良好療效，并具有安全、高效、低毒等優勢。AS易損斑塊的檢測手段多具有損傷性，目前常采用復合因素造模建造雄性家兔AS易損斑塊模型，實驗8周末通過檢測血脂，顯示家兔已形成AS易損斑塊，為進一步觀察蒙藥額爾敦—烏日勒對AS易損斑塊血清及主動脈ET、PAF的干預作用奠定了基礎。實驗結果表明額爾敦—烏日勒能降低AS家兔血清及主動脈ET、PAF水平(P＜0．01)，并且與辛伐他汀組相比，在影響AS易損斑塊家兔主動脈ET水平上具有一定的優勢(P＜0．05)，為臨床尋找他汀類藥物的替代治療提供了科學的實驗依據，亦為臨床運用中蒙藥治療AS提供更加完善的實驗理論和依據。

總之，額爾敦—烏日勒可能通過降低血管內皮因子ET、PAF的上升水平，降低主動脈組織ET的表達，恢復內皮功能的平衡狀態，從而發揮穩定動脈粥樣硬化易損斑塊的作用。

［1］ 李丹，李玉潔，楊慶，等．血管內皮功能障礙與動脈粥樣硬化研究進展［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，18(8):272-276．

［2］ 麻春杰，董平，都格爾，等．額爾敦—烏日勒在家兔動脈粥樣硬化斑塊消退中的作用及其對炎癥因子的影響［J］．世界科學技術—中醫藥現代化，2011，13(5):894-898．

［3］ 董平，麻春杰，溫都蘇，等．額爾敦—烏日勒對實驗性家兔動脈粥樣硬化的影響［J］．中華中醫藥學刊，2011，29(5):1012-1015．

［4］ 烏蘭其其格，麻春杰，董平，等．額爾敦—烏日勒對AS家兔血清NO含量及主動脈eNOS基因表達的影響［J］．中華中醫藥學刊，2015，33(3):603-605．

［5］ 董平．珍寶丸抗動脈粥樣硬化作用及其機制研究［D］．呼和浩特:內蒙古醫學院，2011．

［6］ 都格爾．額爾敦—烏日勒及其優化方對動脈粥樣硬化易損斑塊家兔模型的干預作用［D］．北京:北京中醫藥大學，2014．

［7］ 邱雅慧．血管內皮細胞的功能以及損傷修復與動脈粥樣硬化［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(10):1927-1929．

［8］ Tokumu ra A，Sum ida T，Tou jim a M，et al．Platelet-activating factor(PAF)-like oxidized phospholipids:relevance to atherosclerosis［J］．Biofactors，2000，13(1-4):29-33．