通陽活血方含藥血清對兔缺血再灌注竇房結細胞凋亡和細胞骨架蛋白Vinculin的影響

劉如秀 彭杰 劉宇

病態竇房結綜合征(sick sinus syndrome，SSS)是由于竇房結或其周圍組織病變，導致沖動形成和傳出障礙而產生的心律失常和一系列臨床表現的綜合征。通陽活血方是劉志明老中醫臨證70余年治療SSS的經驗方，臨床療效確切［1］。本實驗采用酶標儀、流式細胞分析儀、激光共聚焦顯微鏡，觀察通陽活血方含藥血清對模擬缺血再灌注兔竇房結細胞凋亡和骨架蛋白形態結構的影響，探討其對體外培養竇房結細胞的保護作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

出生24小時內新西蘭乳兔，雌雄不拘，由北京隆安實驗動物養殖中心提供，批號:11401400000095。

1．2 實驗藥物

通陽活血方藥物組成:附子6 g、紅參10 g、當歸12 g、黃芪 18 g、三七 3 g，經水煎醇提法制成含1 g/mL生藥的無菌中藥原液。含藥血清制備方法:取成年新西蘭大耳白兔40只(由北京隆安實驗動物養殖中心提供，批號:11401400000095)，雌雄各半，用隨機數字表法隨機分為4組，每組10只，通陽活血方含藥血清大劑量組按照每日生藥量54．96 g/kg·體質量(相當于70 kg成人臨床用藥量12倍)、中劑量組按照每日生藥量27．48 g/kg·體質量(相當于70kg成人臨床用藥量6倍)、小劑量組按照每日生藥量13．74 g/kg·體重(相當于70 kg成人臨床用藥量3倍)，分別用蒸餾水配置成混懸液給兔灌胃，每天2次，連續7天;空白血清組給予等量正常飲用水。末次給藥前禁食不禁水12小時，給藥后2小時，耳中央動脈取血，自然分離血清，56℃水浴30分鐘滅活處理，0．2μm微孔濾膜過濾除菌，分裝為通陽活血方含藥血清大、中、小劑量組和空白血清組，－20℃冷存備用。

1．3 試劑

DMEM/F12(1∶1)培養基(美國 Thermo公司產品，批號:NVJ0307);胎牛血清(美國Gibco公司產品，批號:911585);低糖DMEM培養基(美國Hyclone公司產品，批號:DM121501D);胰酶(美晨公司，批號:C1401130);PI-Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京大學醫學部制劑室);一抗:Monoclonal Anti-Vinculin antibody(美國Sigma公司產品，批號:SAB4200080);二抗:Gote Anti-Mouse IgG(H+L)Rhodamine(TRITC)(美國 Bioworld公司產品，批號:BS11502)。

1．4 主要儀器

酶標儀(550型，美國);流式細胞分析儀(BD，美國);激光共聚焦顯微鏡(TCS-NT型，德國);防震臺(TMC63544，美國)。

1．5 方法

1．5．1 竇房結細胞的分離、培養 新生24小時內的乳兔8只，吸入乙醚麻醉，用75%酒精消毒乳兔皮膚及手術區。沿前正中線剪開胸腔，暴露心臟，將心底部大血管剪斷，游離心臟，盡量保留大血管，用PBS充分清洗心臟，解剖鏡下分離竇房結區域(上腔靜脈與右心房交界處)，用PBS清洗分離的組織，剪碎呈約0．5mm，置于15 mL離心管中，加入0.1%胰酶10 mL，37℃下，消化15分鐘，消化完畢，加入5 mL含血清培養基終止消化，用移液槍上下吹打70次，離心400 r/min，5分鐘，將上清液移入另一50 mL離心管，將沉淀的組織塊再加入0.1%胰酶10 mL，同前法消化，終止消化后，吹打，離心，取上清細胞懸液與第一次的細胞懸液合并，如此重復一次，將三次所得的細胞懸液合并至50 mL離心管，1500 r/min離心10分鐘，棄上清，用含血清培養基6 mL重新懸浮細胞。取4個10cm培養皿，各加入10 mL培養基，將細胞懸液等分移入培養基中，置于37℃、CO2濃度5%的細胞培養箱中孵育1小時(差速貼壁)，光鏡下觀察，可見大量纖維細胞，間質細胞貼壁，將上浮細胞取出置于另4個培養皿中培養，24小時后更換新培養基，之后每48小時更換培養基。

1．5．2 模擬缺血再灌注模型建立及實驗分組 以缺氧缺糖模擬缺血，以恢復氧和糖的供應模擬再灌注，用不含胎牛血清的低糖培養基置換原培養基，放入自制的密閉盒中，持續通以N2充分排盡盒內空氣，以模擬缺血。放入培養箱中培養16小時后從密閉盒中取出，更換為正常培養基，以模擬再灌注培養3小時。

將細胞分為正常對照組、模型組、空白血清組、含藥血清高、中、低劑量組。含藥血清高、中、低劑量組及空白血清組分別加入相應兔血清(終濃度10%)，預先培養過夜(約8小時)。造模更換培養基時加入相應含藥血清，造模后取竇房結細胞進行實驗。

1．5．3 細胞活性檢測 將細胞種植于96孔板中，分組，每組取8個復孔，造模后，倒棄培養基，相應檢測孔內加入噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)工作液100μL，于培養箱內孵育3小時，取出吸除MTT工作液，加入DMSO100μL，搖勻，待顏色變化，立即上酶標儀檢測(設定波長570mm)。

1．5．4 細胞凋亡檢測 調整待測細胞濃度為(5×105)～(1×106)個/mL。分組，每組6個樣本，造模后，將細胞消化轉移至流式離心管內，1500rpm，4℃離心5分鐘，棄上清。加入1 mL預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，同上法離心，棄上清，重復3～4次，加入200ul Binding Buffer，輕輕震蕩，使細胞懸浮。加入10μL Annexin V-FITC，輕輕搖勻，避光，室溫反應15分鐘，加入5ul PI，即上機檢測。

1．5．5 細胞骨架蛋白tubulin形態觀察14mm蓋玻片放入24孔板中進行細胞爬片，細胞貼壁后，選取生長良好的細胞進行實驗。分組，造模后吸除培養基，PBS清洗2次，以4%多聚甲醛固定10分鐘;吸除多聚甲醛，加入0．02%Triton，37℃培養箱內靜置15分鐘打孔。PBS清洗3次，加入一抗(1∶500PBS溶液)，放入濕盒內，4℃冰箱孵育過夜;PBS清洗2次，加入二抗(1∶200PBS溶液)常溫孵育1小時，甘油封片后上機檢測，每組取4個視野，圖像采用Image-Pro Plus 6．0進行平均熒光強度分析。

1．6 統計學方法

采用統計程序包SPSS13．0軟件對數據資料進行統計分析，計量資料均用均數±標準差±s)表示，各組數據均服從正態分布，方差齊，多組間資料比較采用完全隨機方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0．05為差異顯著，以 P＜0．01為差異極顯著。

2 結果

2．1通陽活血方含藥血清對竇房結細胞活性的影響

MTT比色檢測結果顯示，模型組活細胞量明顯低于空白對照組(P＜0．01)，證明造模方法可行。空白血清組與模型組比較無統計學意義(P＞0．05)，表明兔血清對實驗無明顯干擾，含藥血清高、中、低劑量組活細胞量明顯高于模型組(P＜0．05)，顯示通陽活血方含藥血清能保護竇房結細胞活性，見表1。

2．2 通陽活血方含藥血清對竇房結細胞凋亡的影響

流式細胞分析儀檢測結果如圖1顯示，模型組細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P＜0．01)。空白血清組與模型組無明顯差異，含藥血清高、中劑量組細胞凋亡率明顯低于模型組(P＜0．05)，低劑量組凋亡率與模型組比較無統計學意義，見表1。

2．3 通陽活血方含藥血清對竇房結細胞骨架蛋白Vinculin的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，空白對照組細胞內Vinculin顯色明顯，數量較多，均勻分布于細胞膜附近(圖D);模擬缺血再灌注后的竇房結細胞質內Vinculin數量明顯減少(圖C)，平均熒光強度明顯低于空白對照組(P＜0．01)(表1);含藥血清高劑量組Vinculin數量較模型組明顯增多，顯色明顯(圖D)，平均熒光強度明顯高于模型組(P＜0．01)(表1);中劑量組Vinculin數量較空白組有所減少，但明顯優于模型組(圖E);空白血清組及低劑量組Vinculin數量較模型組無明顯差異(圖B、D)。可見通陽活血方含藥血清能保護缺血再灌注竇房結細胞Vinculin的形態結構。

表1 各組兔竇房結細胞活性、凋亡率及平均熒光強度

圖1 各組流式細胞分析圖像

3 討論

細胞凋亡在心臟傳導系統的發育成熟中具有重要的作用，竇房結、房室結與傳導阻滯細胞的胚胎發育及出生后數周的發育過程中均有細胞凋亡發生，在竇房結的發育、成熟過程中，凋亡不足可留下引發心率失常的基礎，凋亡過度可引起病態竇房結綜合征等病變［2］。模擬缺血再灌注可誘導培養竇房結細胞凋亡，且隨缺血時間的延長，竇房結細胞凋亡率逐漸增加［3］。鑒于病竇的發病常伴隨缺血性心臟病的出現，故竇房結缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡可能是其病因之一。

心肌骨架系統破壞是缺血再灌注損傷主要的發生機制［4］，Vinculin是細胞骨架系統中重要成分之一，Vinculin在細胞中與細胞微絲骨架相連，并將微絲錨定于細胞膜上，vinculin也介導細胞外基質與細胞骨架的連接，Vinculin在維持細胞形態、調節細胞粘附、運動、增殖及細胞膜內外信號轉導等過程中起重要作用［5］。

圖2 各組Vinculin激光共聚焦顯微鏡圖像

通陽活血方是劉志明老中醫臨證70余年治療病態竇房結綜合征的有效經驗方。劉老認為病竇的病機為心腎陽虛、瘀血阻滯，主要證候為陽虛血瘀。心陽不振，心脈失于溫煦鼓動，氣血運行不利;心陽不能外達，導致陽氣郁閉不通，屬本虛標實之證，治宜以“通陽活血”為基本法則。通陽活血方由附子、人參、當歸等組成。附子辛甘性熱，能溫心腎之陽;人參大補元氣，能助附子之溫，振奮心陽，有扶正祛邪之功;當歸補血活血，溫通經脈，使陽氣外達。諸藥相配，共奏“通陽活血”之功。

本實驗MTT檢測結果中，模型組與空白對照組存活細胞量有明顯差異，表明造模方法可行;空白血清組與模型組無明顯差異，顯示兔血清對實驗結構無干擾。含藥血清高、中、低劑量組存活細胞量都明顯高于模型組，且呈濃度依賴的量效關系，表明藥物濃度選取有效可行。流式細胞檢測結果顯示，模型組細胞大量凋亡，證實缺血再灌注是導致竇房結細胞的凋亡的可能原因;含藥血清高、中劑量組細胞凋亡率明顯低于模型組，顯示通陽活血方能減少細胞凋亡是其治療病竇的可能機制之一。

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示空白對照組細胞Vinculin顯色明顯，數量較多，均勻分布于細胞膜附近;模型組Vinculin數量明顯減少，表明缺血再灌注使Vinculin大量裂解;Vinculin的破壞能導致胞質中微絲失去錨定點，使骨架網狀結構受損，細胞膜失去支持、脆性增加;細胞膜內外信號轉導受阻，從而使竇房結細胞在形態結構及功能方面發生病理改變。而含藥血清高、中劑量組Vinculin都有不同程度的明顯增加。以上實驗結果表明通陽活血方保護骨架蛋白Vinculin是其治療病態竇房結綜合征的可能機制之一。

［1］ 劉金鳳，汪艷麗，徐利亞，等．益氣通陽方治療病態竇房結綜合征臨床觀察［J］．中國中醫藥信息雜志，2014，4(21):1-4．

［2］ JamesTN．Apoptosis in congenital heart disease［J］．Coron Artery Dis，1997，8(10):599-616．

［3］ 鐘理，宋治遠．模擬缺血-再灌注誘導原代培養乳鼠竇房結細胞凋亡的研究［J］．第三軍醫大學學報，2001，1(23):59-61．

［4］ Iwai K，Hori M，Kitabatake A，et al．Disruption of microtubules as an early sign of irreversible ischemic injury．Immunohistochemical study of in situcanine hearts［J］．Circ Res，1990，67(3):694．

［5］ Ziegler WH ，Gingras AR，Critchley DR，et al．Integrin connections to the cytoskeleton through talin and vinculin［J］．Biochem Soc Trans，2008，36(Pt 2):235-239．