隱丹參酮抑制人胃癌SGC—7901細胞增殖的實驗研究

鄧鳳春+++楊鈺+++趙紅曄+++王濱+++周麗++沈云虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響。方法 通過體外無菌傳代培養2013年5月所購的人胃癌SGC-7901細胞，設空白對照組與20 μm、40 μm、60 μm、80 μm和100 μm五個濃度的隱丹參酮組，分別于6 h、12 h、24 h和48 h后采用MTT法檢測隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率，并觀察藥物作用24 h和48 h后細胞的形態變化。 結果 ①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均>50%。②刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的IC50為59.11 μM，③與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間差異無統計學意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統計學意義（P<0.05）。結論 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的增殖有明顯的抑制作用，且有時間和劑量依賴關系；究其原因可能是隱丹參酮能夠誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。

[關鍵詞] 隱丹參酮；人胃癌SGC-7901細胞；MTT；細胞凋亡

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（b）-0049-02

胃癌（Gastric Cancer）是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重危害威脅人類健康[1-3]，因此對胃癌的防治和治療等研究成為腫瘤研究領域的一大熱點課題。傳統中藥以其價格低廉、毒副作用小的優勢，輔助治療胃癌有很好的前景。隱丹參酮（cryptotanshinone）是從活血化瘀中藥丹參中提取出的脂溶性有效成分，具有抑制多種腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡或分化的作用[4]，但有關隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞作用的研究，國內卻鮮有報道。該研究采用MTT法檢測隱丹參酮對SGC-7901細胞（2013年5月購自上海生命科學研究院細胞資源中心）增殖的抑制作用，以期進一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎研究、拓寬隱丹參酮的應用范圍，為胃癌患者的輔助治療提供一種新的思路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 腫瘤細胞 人胃癌SGC-7901細胞于2013年5月購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑 隱丹參酮購自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS） 購自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培養基及細胞消化液胰酶（Tyrisin）為美國Gibco公司產品；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國Sigma公司產品。

1.1.3 主要儀器 細胞培養瓶產自美國Corning公司；細胞培養板及針頭濾器（孔徑：0.2 um）產自美國Costar公司；MR1812高速冷凍離心機產自法國Jouan公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱產自天津市泰新特儀器有限公司；UV-2550 UV-visible speetrophoto meter，SHIMADZU Corporation Assembled in China；倒置顯微鏡（IMT-2）產自Olympus公司；超凈工作臺產自蘇州安泰空氣技術有限公司；5%CO2孵箱產自Thermo Electron Corporation。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲備液，過濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養液稀釋成所需濃度（藥物作用于細胞時，DMSO的終濃度小于或等于0.1% （v/v），該濃度對細胞生長無影響）。

1.2.2 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響 采用MTT法比色法：取96孔培養板，邊緣的孔內加PBS緩沖液填充，中間的孔作為實驗觀察孔。除調零孔不加細胞懸液外，其它各實驗觀察孔，調整細胞懸液濃度，取無菌傳代培養第3～8代細胞，以1×104/孔的密度接種于孔板內，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待細胞穩定生長4 h后，設空白對照組和五個不同濃度的隱丹參酮組（終濃度設梯度為20、40、60、80、100 μM），每種濃度5個復孔。除空白對照組外，每孔中加入相應濃度的隱丹參酮，分別刺激6 h、12 h、24 h、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續培養4 h；小心吸去培養液；每孔加入150 μl DMSO，置37 ℃、5% CO2 細胞培養箱培養10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀570 nm/630 nm測量各孔的吸光值。重復測定3次后，分別計算抑制率。抑制率=（對照組OD值-用藥組OD值）/對照組OD值×100%。（注：每組去掉一個OD值最低值和一個最高值，取剩余三個復孔OD值來計算。）

1.2.3 細胞的形態學觀察 取對數生長的細胞，以5.0×105/孔的密度接種于6孔細胞培養板，設空白對照組和五個不同濃度的隱丹參酮組。待細胞密度長至70%～80%時，除空白對照組外，每孔中加入相應濃度的隱丹參酮，均于作用24 h和48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。

1.3 統計方法

所得數據用均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統計分析軟件的One-Way ANOVA過程進行方差分析，最小顯著差法（Least significant difference，LSD）進行兩兩比較，雙側檢驗以P<0.05表示差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響

采用MTT比色法檢測不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞存活率的影響，結果如表1所示。

結果顯示，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用并不明顯，抑制率均低于35%；刺激24 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用較明顯，抑制率介于33%～72%之間；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用明顯，但最低濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率已超過50%。故選取24 h作為隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞抑制作用的最佳時間。

刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關系（y=0.498x+ 20.56，R2= 0.972），并由此計算出隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的半抑制濃度（IC50）為59.11 μM，如圖1所示；與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01）；各隱丹參酮組間兩兩比較結果為：隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率，在20 μM與40 μM組之間和40 μM與60 μM組之間差異無統計學意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統計學意義（P<0.05）。

圖1 不同濃度隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制增殖曲線

2.2 不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞形態的影響

在倒置顯微鏡下，人胃癌SGC-7901細胞形態如下：空白對照組的SGC-7901細胞呈現梭形，大小均一，細胞壁光滑，折光性好。不同濃度隱丹參酮作用SGC-7901細胞24 h后出現的變化：藥物濃度低時，核染色質固縮、聚集在核膜周邊；隨著藥物濃度加大，大部分細胞的細胞膜出現皺縮、內陷和芽狀突起。48 h 后出現的變化：藥物濃度低時，核染色質固縮、聚集在核膜周邊；藥物濃度適中時，大部分細胞出現凋亡，胞漿濃縮、胞膜起泡，出芽，細胞體積逐漸變小，出現凋亡小體；藥物濃度高時，細胞出現壞死現象，細胞膜破裂，內容物釋放。

3 討論

目前，從丹參中已提取近50種丹參酮及其衍生物[5]，隱丹參酮是眾多丹參酮中的一種，具有改善微循環、清除氧自由基、抗感染等藥理作用，近年來它的抗腫瘤活性陸續被報道[6]。

研究發現隱丹參酮對前列腺癌、膽管癌、黑色素瘤等多種人類腫瘤細胞具有不良反應，引起了廣泛關注[7-9]，但有關隱丹參酮對胃癌的影響少見報道。

該研究通過MTT法檢測不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，結果顯示：①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞的抑制率均>50%。表明隱丹參酮具有抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖的作用，抑制作用的最佳時間為24 h。②刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的IC50為59.11 μM，明顯低于陳春雷等[10]報道的隱丹參酮對人膽管癌HCCC-9810細胞作用24 h的IC50（93.77μM），表明隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用更為顯著。③與空白對照組相比，各隱丹參酮組對人胃癌SGC-7901細胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間無差異無統計學意義（P分別為0.162和0.110）之外，其余各組間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮對人胃癌細胞SGC-7901增殖的抑制作用呈現一定的濃度依賴性。

不同濃度隱丹參酮作用人胃癌SGC-7901細胞，細胞呈現不同的形態特征，濃度很低時，胞質均勻，DNA逐漸變成不規則狀，核質固縮聚集，有出泡現象。隨著濃度增加，細胞出現明顯的核固縮，染色質片段化和邊緣化，形成凋亡小體；最后細胞呈壞死狀，細胞變圓，裂解，漂浮于培養液中。實驗結果表明，隱丹參酮能夠誘導人胃癌SGC-7901細胞的凋亡，且細胞凋亡在一定范圍內跟藥物濃度呈依賴性關系。

今后，該研究將從細胞、分子及基因水平探索隱丹參酮抗腫瘤作用機理，以期進一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎研究、拓寬隱丹參酮的應用范圍，為其在腫瘤治療領域的臨床應用積累試驗和理論依據。

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（收稿日期：2014-09-11）endprint