CerbB-2、MDR1/P-gp蛋白在乙狀結腸黏液腺癌中的表達及意義

張劍虹 張飛 張曉麗 劉博 劉君超

乙狀結腸黏液腺癌發病率逐年升高，預后差，化療作為一種綜合治療手段，廣泛應用于臨床，但腫瘤細胞耐藥是化療失敗的重要原因，腫瘤 細 胞 的 多 藥 耐藥(mutidrug resistance，MDR)機制的存在可造成化療的失敗，MDR已是當前乙狀結腸黏液腺癌化療過程必須關注的問題。隨著分子生物學的飛速發展，耐藥基因及其產物的檢測為化療方案的選擇提供了科學有力的依據。本研究通過檢測MDR1/P-gp在乙狀結腸黏液腺癌中表達情況，同時分析MDR1/P-gp與CerbB-2在乙狀結腸黏液腺癌治療及預后的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學院附屬第一醫院病理科2008至2013年手術切除乙狀結腸黏液腺癌存檔蠟塊86例，臨床資料完整，年齡28～62歲，平均年齡45歲，術前均未接受化療、放療及內分泌治療。乙狀結腸黏液腺癌的診斷標準按WHO腸道腫瘤組織學分型進行，所有樣本切片均兩位有經驗高年資病理醫師證實為黏液腺癌。乙狀結腸黏液腺癌按臨床TNM分期分Ⅲ期，Ⅰ期26例、Ⅱ期39例、Ⅲ期21例;腋窩淋巴結轉移35例、無腋窩淋巴結轉移51例;≤4 cm的腫瘤37例、＞4 cm腫瘤49例。所有患者均為首次發病，無腸癌家族遺傳史。

1.2 組織芯片制備 組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫院腫瘤研究所完成，過程如下:組織載玻片經過夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚賴氨酸行防脫片處理，對每一組織標本，觀察HE切片，選取目標組織并在HE切片及其相應石蠟組織塊(供體蠟塊)上標記，萊卡石蠟空白蠟塊(受體蠟塊)與蜂蠟混合(比例為1∶1)，制成2.2 cm ×3.5 cm ×1 cm 大小蠟塊，用加拿大生產CDX718組織芯片儀打孔制成帶孔空白蠟塊，將蠟塊放在39～42℃水浴中軟化后，用組織芯片儀從供體蠟塊標記部位逐個取出直徑1 mm高4 mm的組織柱，推入空白蠟塊預先設計的相應孔內，這樣在空白蠟塊上制作完成了68個組織芯片，為防止染色過程中脫片，每例標本上樣四個點，分別安插在空白蠟塊1和2中，對蠟塊進行連續切片，裱于防脫片處理的載玻片上。見圖1。

圖1 組織芯片蠟塊

1.3 免疫組織化學方法 MDR1/P-gp、CerbB-2單克隆抗體及SP法免疫組織化學染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物試劑有限公司，組織經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，HE染色，光鏡分期，采用S-P法，進行免疫組化染色，主要免疫組織化學步驟:石蠟包埋組織切片4 μm厚，常規脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫下10 min，以阻斷內源性過氧化物酶;充分水洗，與pH值6.0的檸檬酸緩沖液中高壓鍋處理10 min后，室溫冷卻;非免疫羊血清封閉 10 min后，加入即用型鼠單抗 MDR1/P-gp、CerbB-2，4℃冰箱過夜，再加入生物素化羊抗鼠IgG和S-P復合物。以DAB液顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，封片。用TBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 陽性判斷標準 陽性結果判斷根據以下兩方面的總分進行判斷:(1)選染色均勻的陽性表達區域，5個高倍視野計數陽性細胞，以陽性細胞所占百分比為5級計分:陽性細胞率＜5%為0分;陽性細胞率5% ～25%為1分;陽性細胞率26% ～50%為2分;陽性細胞率51% ～75%為3分，陽性細胞率＞75%為4分。(2)按染色強度來分:不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)，以上方法均由2名有經驗的高年資病理醫師采用雙盲法獨立檢測，取平均值。CerbB-2的陽性表達以細胞膜出現清晰棕黃色顆粒為陽性，MDR1/P-gp以細胞漿內有棕色顆粒著色者為陽性。高倍鏡下計數10個高倍視野，陽性細胞記數＞10%，判定為陽性。陽性細胞記數＜10%，判定為陰性。

1.5 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件，計數資料比較，采用χ2檢驗和線性相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織染色 乙狀結腸經組織學證實為黏液腺癌，黏液位于腺上皮細胞內及細胞外。CerbB-2在乙狀結腸黏液腺癌中的表達，分布特點:CerbB-2陽性細胞可見細胞膜呈完整或不完整淺-棕黃色顆粒，密度不均勻，與血管走行無規律性。MDR1/P-gp在乙狀結腸黏液腺癌中的表達分布特點:MDR1/P-gp陽性細胞可見細胞漿內呈淺-棕黃色顆粒，密度分布較均勻，與血管走行無規律性。見圖2～5。

圖2 乙狀結腸黏液腺癌(HE×400)

圖3 乙狀結腸黏液腺癌(HE×400)

圖4 CerbB-2在乙狀結腸黏液腺癌中表達，細胞膜呈棕黃色顆粒(SP×400)

圖5 MDR1/P-gp在乙狀結腸黏液腺癌的表達，細胞漿呈棕黃色顆粒(SP×400)

2.2 乙狀結腸黏液腺癌CerbB-2與MDR1/P-gp表達與臨床病理因素關系 CerbB-2在臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的陽性表達率分別為 42.30%、38.46%、76.19%，Ⅰ、Ⅱ期相比無明顯差異，臨床Ⅲ期和Ⅰ、Ⅱ期比較差異有統計學意義(P＜0.05)，顯示臨床分期越高，CerbB-2陽性表達率越高。CerbB-2在有腸系膜淋巴結轉移組陽性率為65.71%，在無腸系膜淋巴結轉移組陽性率為37.25%，有腸系膜淋巴結轉移組CerbB-2的陽性表達明顯高于無腸系膜淋巴結轉移組(P＜0.05)。CerbB-2的表達與腫瘤大小無明顯相關性(P＞0.05)。MDR1/P-gp在有腸系膜淋巴結轉移組的陽性表達率為62.85%，在無腸系膜淋巴結轉移組陽性表達率為29.41%，有腸系膜淋巴結轉移組MDR1/P-gp的陽性表達明顯高于無腸系膜淋巴結轉移組(P＜0.05)。MDR1/P-gp陽性表達率與乙狀結腸黏液腺癌的臨床分期，腫瘤大小無明顯相關性(P＞0.05)。見表1。

表1 乙狀結腸黏液腺癌CerbB-2與MDR1/P-gp表達與臨床病理的關系 例(%)

2.3 CerbB-2與MDR1/P-gp表達的關系 37例乙狀結腸黏液腺癌MDR1/P-gp表達陽性患者中，CerbB-2同時表達陽性者占72.97%(27/37)，CerbB-2表達陰性者占54.05%(20/37)，兩者差異有統計學意義(P＜0.05);MDR1/P-gp表達陰性者，其CerbB-2表達差異無統計學意義。CerbB-2與MDR1/P-gp的陽性表達具有一定正相關性。見表2。

表2 CerbB-2表達與MDR1/P-gp蛋白表達的關系 例(%)

3 討論

乙狀結腸黏液腺癌患者的預后取決于腫瘤細胞自身的生物學特性，以及對化療藥物的敏感程度，研究不同個體乙狀結腸黏液腺癌細胞多藥耐藥基因蛋白MDR1/P-gp、癌基因標志物CerbB-2的表達，可推測腫瘤細胞惡性程度、局部侵襲、遠處轉移能力，研究最有效的個體化療方案，提高患者的生存率及預后水平。

P-gp是MDR1的表達產物，是由1280個氨基酸構成的跨膜蛋白［1］，在 ATP的參與下P-gp發生能量依賴性變構，通過激活ATP泵，將多種抗生素類和植物類化療藥物(如多柔比星、長春新堿類、紫杉醇等)排出細胞外，使細胞內藥物蓄積濃度下降，藥物作用降低或完全喪失，從而阻斷化療藥物作用的發揮，細胞產生耐藥［2］。這種藥物外排機制稱為經典的 MDR機制。P-gp表達水平與耐藥程度成正相關［3］。MDR1/P-gp在正常肝膽管、胰管、胃腸、腎、腎上腺等具有分泌排泄功能的細胞有表達［4］，起著清除毒性化合物的功能。乳腺癌、胃癌、肺癌等亦有較高表達。有研究表明，P-gp高表達與乳腺癌腫瘤侵襲性、淋巴結轉移相關并與CerbB-2表達呈正相關;P-gp陽性表達與直腸癌病理分期和遠期生存率有關［2］。本實驗采用免疫組化法，檢測86例乙狀結腸黏液腺癌MDR1/P-gp蛋白表達水平，其 MDR1/P-gp陽性表達率為43.02%(37/86)，同時發現MDR1/P-gp表達與患者臨床分期無明顯相關性，而與腸系膜淋巴結轉移有關，說明有腸系膜淋巴結轉移患者更容易發生MDR，據隨訪資料MDR1/P-gp陽性表達者術后5年生存率低于陰性表達者，提示MDR1/P-gp是影響乙狀結腸黏液腺癌患者預后的因素之一，推測其與化療敏感性及療效有關。本次研究采用的乙狀結腸黏液腺癌標本術前均未接受化療，表明MDR1/P-gp參與介導的乙狀結腸黏液腺癌耐藥可能是原發性耐藥。

CerbB-2基因是乙狀結腸黏液腺癌最主要的癌基因標志物之一，又稱為HER-2，其編碼產生的CerbB-2蛋白是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性［5］，CerbB-2基因主要在胚胎發育時表達，而在乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中存在CerbB-2基因異常表達，CerbB-2與表皮生長因子(EGFR)有著類似的結構與功能［6］，當細胞受到不良刺激導致CerbB-2基因激活，CerbB-2編碼蛋白增多及活性增強，導致細胞凋亡被抑制;酪氨酸激酶自磷酸化，信息通道打開激活細胞內多種基因，使細胞增殖加快［7］;CerbB-2通過對 Bcl-2α、β整合蛋白和黏附分子的相互作用，破壞了機體反侵襲屏障，導致癌細胞轉移力增強;CerbB-2對血管內皮生長因子有上調作用，從而促進瘤組織內血管增生，加快腫瘤生長速度［8］。對于CerbB-2的表達與結直腸癌的發生、發展以及預后的關系，國內外報道不一，有的報道CerbB-2蛋白在結直腸癌的陽性表達率很低，并且CerbB-2的表達與結直腸癌Dukes分期、預后等均無相關性，不能反映侵襲、轉移情況［9］;有的報道CerbB-2蛋白陽性表達與Dukes分期相關，并能反映淋巴結轉移、預后的關系［10］。本研究結果顯示，乙狀結腸黏液腺癌中CerbB-2陽性表達率為48.83%(42/86)，臨床Ⅲ期和Ⅰ、Ⅱ期比較差異有統計學意義(P＜0.05)，臨床分期越高，CerbB-2陽性表達率越高。有腸系膜淋巴結轉移組CerbB-2的陽性表達明顯高于無腸系膜淋巴結轉移組(P＜0.05)。CerbB-2陽性表達與腫瘤臨床分期，淋巴結轉移正相關，證實CerbB-2癌基因高表達，CerbB-2編碼蛋白活性增強，使癌細胞增殖加快，促進瘤組織內血管增生，使癌細胞侵襲力增強，具有更高的臨床分期和淋巴結轉移率。本實驗表明CerbB-2的異常表達在乙狀結腸黏液腺癌的發生、發展中可能起著重要作用，提示CerbB-2可作為乙狀結腸黏液腺癌診斷的生物學參考指標，部分CerbB-2呈高表達的患者，通過特效藥物阻斷癌細胞中CerbB-2基因表達而達到治療乙狀結腸黏液腺癌的目的。

本研究中MDR1/P-gp與CerbB-2基因的表達均與腫瘤大小無相關性，提示MDR1/P-gp與CerbB-2基因均影響了癌細胞本身的生物學特性，而與癌細胞的數量和體積無關。

本實驗MDR1/P-gp蛋白陽性表達組中，CerbB-2同時陽性表達率高于CerbB-2蛋白陰性表達組，差異有統計學意義，說明MDR1/P-gp、CerbB-2基因共表達在乙狀結腸黏液腺癌是存在的，并且CerbB-2基因的表達與多藥耐藥的激活有關，CerbB-2過表達的乙狀結腸黏液腺癌患者發生多藥耐藥的可能性較大。近年來發現，MDR1與CerbB-2過表達在耐藥和轉移方面生物學特性相似。CerbB-2過表達是否上調MDR1/P-gp水平，MDR1/P-gp表達是否對CerbB-2的表達水平有正反饋作用，二者在乙狀結腸黏液腺癌中的表達機制仍需進一步研究探討。

本研究結果顯示，乙狀結腸黏液腺癌中存在MDR1/P-gp與CerbB-2基因共表達，聯合檢測可為乙狀結腸黏液腺癌患者綜合治療方案的選擇提供重要的依據。

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