大鼠急性顱腦損傷后IL-8在顱內(nèi)表達(dá)的動態(tài)觀察

王恒 邵恩得 張金榮

近幾年來顱內(nèi)炎性損傷，特別是白細(xì)胞在繼發(fā)腦損傷中的作用，日益受到重視。白介素-8(IL-8)作為中性粒細(xì)胞趨化的關(guān)鍵因子，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多疾病的病理損害過程。本研究通過動態(tài)觀察實驗性大鼠急性顱腦損傷后IL-8在顱內(nèi)的表達(dá)變化及腦含水量情況，探討IL-8在腦損傷后腦組織繼發(fā)性損傷中的作用，以期為腦外傷的治療提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 健康成年SD大鼠70只，體重250～300 g，雌雄不限(由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，隨機(jī)分為對照組和腦損傷后12、24、72、120 h，7、14 d組，每組 10 只大鼠。采用液壓打擊致傷法制作大鼠急性腦損傷模型，對照組大鼠只行顱骨開窗，不做液壓打擊。將各組動物按時間點斷頭處死，取挫傷灶前緣2 mm處腦皮質(zhì)經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋，用免疫組化方法觀察腦挫傷后大鼠腦組織IL-8的表達(dá)情況。另取挫傷灶邊緣(200±50)mg腦皮質(zhì)，用干濕重法測量腦含水量。

1.2 免疫組化檢測IL-8 將包埋好的大鼠挫傷腦組織標(biāo)本切成厚4μm切片，采用SP免疫組化染色法觀察IL-8的表達(dá)(IL-8抗體購自武漢博士德公司)。DAB鏡下顯色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。于顯微鏡下隨機(jī)取5個視野攝像，采用Image-proplus 5.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性區(qū)域平均光密度值。

1.3 腦含水量測定 6組實驗大鼠按時間點斷頭處死后立即開顱，取腦挫傷灶邊緣約2 mm處腦皮質(zhì)約(200±50)mg，用濾紙吸干表面水分，放在鋁箔上用電子天平稱濕重，然后置恒溫干燥箱內(nèi)，100℃烘烤24 h，取出秤干重后計算腦組織含水量。參照Elliot公式計算，腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差分析有顯著性差異時，進(jìn)一步用q檢驗作兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 損傷后12 h時即可見壞組織死周圍和皮層散在表達(dá)IL-8的棕黃色陽性細(xì)胞，24 h時陽性細(xì)胞明顯增多達(dá)到高峰，不僅在神經(jīng)元表達(dá)，也在膠質(zhì)細(xì)胞、部分血管內(nèi)皮細(xì)胞以及聚集成堆的中性粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá);傷后72 h陽性細(xì)胞開始減少，但經(jīng)過光密度值檢測仍高于對照組。損傷后7 d陽性細(xì)胞略有所回升，至損傷后14 d陽性細(xì)胞明顯減少，基本趨于平穩(wěn)。損傷后病變側(cè)各時間點陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2 腦含水量測定 假手術(shù)組大鼠各時間點腦組織含水量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。損傷組各時間點(除傷后14 d)腦含水量與假手術(shù)組相比均有增高(P＜0.05)，在傷后24 h達(dá)高峰，持續(xù)到72 h，傷后14 d時腦含水量較對照組雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 IL-8表達(dá)的光密度值與腦含水量測定分析n=10，±s

表1 IL-8表達(dá)的光密度值與腦含水量測定分析n=10，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05

時間 IL-8表達(dá)的光密度值假手術(shù)組 腦損傷組腦含水量(%)假手術(shù)組 腦損傷組12 h 0.00489 ±0.00049 0.14807 ±0.00362* 78.33 ±0.71 80.98 ±0.76*24 h 0.00465 ±0.00085 0.61766 ±0.01027* 78.61 ±0.73 86.12 ±0.73*72 h 0.00432 ±0.00076 0.40717 ±0.00362* 78.67 ±0.36 84.25 ±0.30*120 h 0.00414 ±0.00101 0.30468 ±0.00188* 78.59 ±0.32 81.21 ±0.17*7 d 0.00461 ±0.00017 0.37293 ±0.00364* 78.14 ±0.38 79.41 ±0.43*14 d 0.00434 ± 0.00035 0.08321 ± 0.00662*78.24 ±0.42 78.81 ±0.34

圖1 傷后各時間點大鼠腦組織IL-8表達(dá)(免疫組化×400)1:損傷組12 h;2:損傷組24 h;3:損傷組72 h;4:損傷組7 d;5:損傷組 14 d;6:對照組

3 討論

近年來國內(nèi)外研究結(jié)果表明，腦外傷所激發(fā)的局部炎性反應(yīng)在傷情的發(fā)展和預(yù)后方面起著重要的作用。局部神經(jīng)組織的變性壞死、腦血流自身調(diào)節(jié)功能的改變、細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生等都與炎性反應(yīng)有著密切的聯(lián)系［1，2］。

IL-8是趨化中性粒細(xì)胞游走并聚集到損傷部位的關(guān)鍵因子，我們通過液壓打擊法復(fù)制大鼠急性顱腦損傷模型，結(jié)果顯示傷后損灶周圍IL-8的表達(dá)急劇增加，腦含水量也明顯增高，并且在損傷早期IL-8的表達(dá)與腦水腫的變化情況具有時間上的相關(guān)性，即IL-8的表達(dá)先于腦含水量的增高而增高，又先于腦含水量的下降而下降。提示我們IL-8參與了顱腦損傷后早期腦水腫的形成等一系列繼發(fā)性腦損傷過程。

繼發(fā)性腦損害主要表現(xiàn)為腦組織水腫，進(jìn)行性顱內(nèi)壓升高，腦損傷灶及其周圍組織進(jìn)行性缺血、缺氧、壞死等，其根本原因就是血管的微循環(huán)障礙、血管通透性的增加及血腦屏障的破壞。

首先，IL-8對白細(xì)胞特別是腦組織中的中性粒細(xì)胞據(jù)有特異趨化和激活作用。腦外傷后外周白細(xì)胞在趨化因子的作用下進(jìn)入腦組織，IL-8作為很強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子，趨化和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在損傷區(qū)的浸潤，當(dāng)其聚集于受損腦組織周圍時，又可分泌更多IL-8，從而形成一個正反饋調(diào)節(jié)。中性粒細(xì)胞可黏附于壞死區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，造成毛細(xì)血管阻塞，機(jī)械性阻塞微循環(huán)，進(jìn)而影響腦組織血液供應(yīng)［3］。中性粒細(xì)胞在活化和黏附過程中還可釋放毒性產(chǎn)物和破壞性的酶，其中被認(rèn)為有介導(dǎo)組織損傷作用的酶有髓過氧化物酶、膠原蛋白酶和彈性蛋白酶等，可導(dǎo)致腦血管損傷、通透性增大，最終引起腦組織水腫。

Yatsiv等［4］曾發(fā)現(xiàn)血腦屏障的功能紊亂與顱內(nèi)IL-8水平密切相關(guān)，并通過動物試驗證實，注射IL-8可以引起血腦屏障通透性的增加。在不同的體內(nèi)外實驗中還發(fā)現(xiàn)IL-8有介導(dǎo)中性粒細(xì)胞依賴的微血管損傷的作用，通過預(yù)先去除外周血中白細(xì)胞或運(yùn)用IL-8抗體可明顯減輕直接注射IL-8引起的血腦屏障通透性的增加［5，6］。

此外，IL-8還可以改變中性粒細(xì)胞表面CD11/CD18黏附分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和穿透能力，以及抑制中性粒細(xì)胞的凋亡而延長其壽命，并使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，釋放溶酶體酶和氧自由基，導(dǎo)致腦外傷后的進(jìn)一步損傷［7］。

本研究還觀察到在大鼠顱腦損傷后7 d，腦組織中IL-8的表達(dá)又有小幅度的回升，而此時腦組織含水量以基本平穩(wěn)，正處于緩慢下降的趨勢。據(jù)Kossmann等［8］研究證實IL-8有誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)生長因子的作用。從本次試驗觀察到的現(xiàn)象推測，IL-8可能在損傷后期通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長因子的表達(dá)參與了神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)過程。

由此可見IL-8在急性顱腦外傷后的損傷與修復(fù)的過程中扮演著雙重角色，是否可以對IL-8進(jìn)行選擇性抑制以減輕腦外傷后的繼發(fā)性腦損傷還需要進(jìn)一步深入研究。

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2 呂麗霞，張玲，韓媛，等.腦外傷患者腦脊液 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10水平變化及臨床意義.山東醫(yī)藥，2013，53:8-10.

3 Biagas KV，Gaeta ML.Treatment of traumatic brain injury with hypothermia.J Curr Opin Pediatr，1998，10:271-277.

4 Yatsiv I，Morganti-Kossmann MC，Perez D，et al.Elevated intracranial IL-18 in humans and mice after traumatic brain injury and evidence of neuroprotective effects of IL-18-binding protein after experimental closed head injury.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22:971-978.

5 樊成，龔年春，陳波，等.急性腦外傷患者血漿Fas，IL-6和IL-8水平變化及意義.臨床外科雜志，2007，16:352.

6 譚斌.新生兒缺氧缺血性腦病與NO、IL-6、IL-8水平相關(guān)性研究.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2005，21:629-630.

7 Morganti-Kossmann MC，Rancan M，Otto VI，et al.Role of cerebral inflammation after traumatic brain injury:a revisited concept.Shock，2001，16:165-177.

8 Kossmann T，Stahel PF，Lenzlinger PM，et al.Interleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood-brain barrier dysfunction and nerve growth factor production.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17:280-289.