疑似結核患者T-SPOT.TB檢測結果分析

雷紅鴿 張敏 韓豐娟 閆小平

2000年全國結核病流行病學調查顯示，全國受結核感染人數約為5.5億人，其中傳染性肺結核患者150萬人［1］。結核菌素試驗常用于結核感染的篩查，但因其假陽性率高，受卡介苗和機體免疫狀態影響較大，使其應用受到限制，目前TST試驗常用于3歲以下兒童結核感染的篩查。結核抗體和結核蛋白芯片是從血清學水平檢查機體受結核菌感染情況，結核抗體檢查體內總的抗體，而結核蛋白芯片同時可以檢測五種結核菌特異抗體(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，聯合檢測不僅可以提高其靈敏度，還可區分活動性感染和既往感染。由于結核桿菌感染機體后主要引起的細胞免疫，抗體產生的時間和量影響結核菌感染的早期診斷，同樣受到機體免疫力的影響。而TSPOT-TB實驗是從細胞免疫水平來檢測結核菌感染，不受機體免疫和卡介苗的影響，采用結核菌特有的抗原ESAT-6和CFP-10作為靶抗原，有較高的靈敏度和特異性。我們用TSPOT-TB和結核蛋白芯片兩種方法檢測臨床可疑結核患者236例，探討兩者在結核感染診斷中的敏感性和特異性，聯合檢測的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1～7月我院住院疑診或待排除結核患者236例，收集每位患者臨床資料及結核病史、結核接觸史、家庭史以及其他疾病史。其中男128例，女108例;年齡3～88歲，平均年齡48.68歲;最后確診為結核患者共168例，其中肺結核為130例，痰涂片陽性7例，結核性胸膜炎為20例，結核性腹膜炎1例，腎結核1例，骨結核1例，淋巴結核4例，脊椎結核1例，附睪結核1例，結核性腦膜炎4例，膝關節結核1例，腰椎結核1例，胸椎結核1例，卵巢結核1例，髂關節結核1例。排除結核68例，肺部感染20例，支氣管感染18例，肝硬化1例，淋巴結炎6例，甲狀腺腫1例，間質性肺炎6例，心包積液1例，HIV感染1例，非結核感染性胸膜炎6例，肺癌1例，胸膜間皮瘤1例，布病1例，支原體肺炎2例，腸梗阻1例，脂肪肝1例，乙肝并發熱1例。見表1。

表1 168例確診結核患者臨床資料表 例

1.2 方法

1.2.1 TSPOT.TB 檢測:根據試劑盒(Oxford Immunotec，Oxford，UK)操作。肝素抗凝管采集外周靜脈血5 ml，分離周血單個核細胞采用密度梯度離心法。在已包被抗IFN-γ抗體的微量板的4個孔中，分別加入陰性對照細胞培養液，陽性對照植物血凝素，A抗原(ESAT-6)和B抗原(CFP10)。然后每孔加入2.5×105濃度的外周血單個核細胞，輕混勻后放入5%的CO2培養箱中溫育16～20 h，PBS洗板后，加入堿性磷酸酶標記的IFN-γ抗體4度孵育1 h，PBS洗脫，加入顯色劑室溫顯色，PBS終止。采用放大鏡人工計數每孔中的斑點數，陽性結果判斷標準為:陰性對照孔中斑點數為0～5，抗原A和抗原B孔中斑點數-陰性對照孔中斑點數≥6;當陰性對照孔斑點數≥6時，抗原A和抗原B孔中斑點數≥2倍陰性對照孔斑點數。

1.2.2 結核蛋白芯片檢測:采用生物微矩陣序列將結核五種特異抗原標記到芯片上(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD和16 kD)，檢測疑診患者血清中相應的抗體。采集疑診患者靜脈血3 ml分離血清，按照蛋白質芯片操作要求進行操作，結果計算在蛋白芯片分析儀上完成。結果判斷讀如下:CFP-10和ESAT-6兩者任一項陽性為活動性結核感染，LAM、38 kD和16 kD任兩項陽性為結核菌感染，任何一項單獨陽性結合臨床，高度懷疑結核菌感染。

1.2.3 結核診斷:綜合考慮臨床表現、放射影像學、病原學以及抗結核治療反應等最后作出肺結核和肺外結核的臨床診斷。

1.2.4 評價指標:采用敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陰性和陽性似然比作為統計學指標。

1.3 統計學分析 率的比較采用χ2檢驗，分析兩種試驗方法診斷效能的一致性用MeNeMar檢驗，一致性強度采用κ系數，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核蛋白芯片與T-SPOT.TBB診斷效能一致性分析 2種檢驗方法雖然總體檢測結果陽性率差異有統計學意義(χ2=10.11，P＜0.01)，但一致性較弱(κ=0.192)。在結核患者中T-SPOT.TB各種診斷指標均高于結核蛋白芯片(χ2=30.7，P＜0.01)，兩者的一致性為一般(κ=0.48)，在非結核患者中，T-SPOT.TB的診斷效驗均顯著高于結核蛋白芯片差異無統計學意義(P＞0.05)，兩者一致性較差(κ =0.194)。見表2。

表2 結核蛋白芯片與T-SPOT.TB兩種方法診斷效能分析表

2.2 結核蛋白芯片與T-SPOT.TB評價指標比較 TSPOT.T.B實驗對結核的診斷敏感性為84.5%，特異性為92.6%，PPV 為 91.8%、NPV 為 72.7%，均高于結核蛋白芯片(P＜0.05);陽性似然比LR+為5.45，高于芯片1.13，陰性似然比 LR-為 0.09，明顯低于結核蛋白芯片0.19，兩者聯合檢測可以提高檢測靈敏度(94.0%)和特異性(98.5%)。見表3。

表3 結核蛋白芯片與T.SPOT.TB檢測評價指標 %

2.3 假陽性和假陰性患者臨床特點 結核蛋白芯片主要檢測結核感染患者體內特異性抗體，結核菌感染后主要為細胞免疫，體液免疫較弱，抗體產生的時間和量與機體免疫狀態有關，38 kD和16 kD少數情況下受卡介苗的影響，當感染機體抵抗力低下或處于感染早期，就可能出現假陰性的結果;相反若近期接種過卡介苗(1例16 kD陽性)，或有其他病原體活動性感染(布氏桿菌感染導致38 kD陽性)以及腫瘤患者(2例LAM陽性)可以出現假陽性結果，但所有假陽性患者中無ESTA-6和CFP-10抗體陽性，說明這兩項指標是結核分枝桿菌所特有，不受其他因素影響，且任何一項陽性均為活動性結核。T-SPOT.TB檢測中出現假陽性5例，其中A抗原(ESAT-6)陽性3例，B抗原(CFP-10)陽性1例，1例兩者均陽性，5例患者A、B抗原孔的斑點數均＜10，既往結核史2例，惡性腫瘤2例(胸膜間皮瘤和轉移性肺癌)，1例慢性肝炎患者曾接受過干擾素抗病毒治療。假陰性26例，平均年齡為68.5歲，外周血中淋巴細胞細胞絕對值低于1.0×109者為10例，分離的單個核細胞計數低于2.0×105者為5例，其余11例中有肺結核4例，淋巴結核2例，腎結核1例，腰椎結核1例，結核性腦膜炎1例，結核性胸膜炎2例。

2.4 肺結核和肺外結核患者T-SPOT.TB與結核蛋白芯片結果分析 T-SPOT.TB在肺結核患者中陽性率為89.2%(116/130)，肺外結核陽性率為 73.6%(26/38);結核蛋白芯片在肺結核陽性率為53.8%(70/130)，肺外結核陽性率為50%(19/38)。T-SPOT.TB實驗在肺結核的診斷中明顯高于結核蛋白芯片(P＜0.01)，在肺外結核的診斷中陽性率差別無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

快速診斷和早期治療結核是發展中國家結核防治的重點。由于我國卡介苗接種率高，TST假陽性率高［2］，結核蛋白芯片敏感性較低，特別是在免疫抑制人群中的低反應性限制了它們的應用。但結核蛋白芯片具有高通量，簡便快速的特點，同時檢測五種結核桿菌的特異性抗體(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，五種抗體聯合檢測可以提高靈敏度和特異性。結核病原學診斷是金標準，但受標本中菌數量影響較大，且結核菌培養時間長，陽性率低，標本類型也受限制，不利于結核病的早期診斷和治療。T-SPOT.TB實驗方法與其他相比，有較高的靈敏度和特異性，結核感染患者外周血T淋巴細胞被RD1編碼抗原活化后分泌IFN-γ，后者被微孔板上抗體結合，加酶和顯色劑形成色素斑點，根據斑點數來判斷結核感染情況，而正常人和非結核分枝桿菌感染患者外周血T淋巴細胞則不會被刺激產生 IFN-γ，因而理論上而言，TSPOT.TB試驗對診斷結核感染應有較高的特異性。

本研究結果也顯示，T-SPOT.TB診斷結核的敏感性(84.5%)與特異性(92.6%)均高于結核蛋白芯片的敏感性(53.0%)和特異性(83.8%);具有較高的陽性預測值(96.5%)，陰性預測值為70.8%，低于相關的報道［3］，表明T-SPOT.TB實驗在結核的診斷中有重要作用，對結核的早期診斷起到一定作用。T-SPOT.TB試驗的陽性似然比明顯高于結核蛋白芯片，而陰性似然比明顯低于結核蛋白芯片，提示T-SPOT.TB作為結核分枝桿菌感染的篩檢方法是適合的，特別適用于疑難結核的診斷，它與結核蛋白芯片聯合檢測能提高結核感染診斷的靈敏度(94.0%)和特異性(98.5%)，陰性預測值達到84.1%陽性預測值為98.8%，正確率為(92.0%)，均高于兩種方法單獨檢測的統計指標，靈敏度和陰性預測值有統計學意義(P＜0.05)，在臨床可以將兩者聯合用于結核感染的篩檢。

在肺外結核的診斷中，T-SPOT.TB實驗的靈敏度和特異性均高于結核蛋白芯片，免疫抑制狀態患者更需要對肺外結核作出早期迅速診斷，特別是使用免疫抑制劑人群的結核篩檢，漏檢會導致結核感染的活動或擴散，增加藥物應用風險［4－6］。本研究顯示，結核蛋白芯片假陰性率高均與免疫狀態、高齡、嚴重疾病、自身免疫病有關，說明結核蛋白芯片在免疫抑制狀態下易出現假陰性，敏感性較低，而T-SPOT.TB則補充了結核蛋白芯片的不足，更適合于接受免疫抑制劑治療患者的結核篩查。有研究報道，嚴重肺結核患者對RD1肽段反應性低，對RD1肽段反應性高低與細菌抗原負荷相關［7－9］，本研究中10例假陰性患者的原因不明和陰性預測值低于相關文獻資料，是否可以用此解釋，尚需進一步研究。

雖然本研究顯示，T-SPOT.TB對結核總體診斷有很高的特異性和靈敏感性，但隨著研究樣本數量的增大，在臨床應用的深入，引起的假陰性的原因也增多，假陰性比例增加，陰性預測值會降低;同時不能區分活動性和隱匿性結核感染。而結核蛋白芯片雖然靈敏度和陰性預測值低，但可以區分活動性感染和隱匿性感染，本研究也顯示兩者聯合檢測可以增加靈敏度和特異度，陰性預測值和陽性預測值分別達到92.0%和98.5%，所以建議在臨床上兩者聯合檢測，降低假陰性率，提高結核感染的診斷率，同時可以提高活動性結核的檢出率。

根據我院患者檢測和臨床資料，斑點數的多少與病情嚴重程度不相關，與活動性也不相關。我們統計T-SPOT.TB檢測結果斑點數＞100的患者36例，血沉＞20 mm/h的為20例，斑點數的多少與血沉升高程度不相關;CRP＞25 ng/ml者有22例，斑點數多少與CRP值高低無相關性，血沉增加程度與CRP升高一致性較好(κ =0.69)，因此從目前研究來看，T-SPOT.TB作為對結核診斷有較高靈敏度和特異性的方法，正在普及臨床應用，特別是對于免疫抑制劑使用的患者和免疫力低下人群結核篩查有重要意義，但斑點數的多少與結核感染活動性及嚴重程度的相關性需進一步探討，需要更多的臨床資料去證實和研究。

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