復合益生菌對刺參非特異性免疫和抗病力的影響

憨素連，王福強*，王 晶，劉晨敏

(大連海洋大學動物營養與飼料實驗室，遼寧大連116023)

刺參是我國黃渤海海域最有經濟價值的水產養殖品種之一。然而，大規模、高密度的刺參人工養殖、藥物濫用常常會導致生態破壞、水質惡化、刺參的疾病和死亡大規模暴發等問題。研究表明，在飼料中添加益生菌，除了能增加飼料的適口性和提高養殖動物的增重率外，還可以增強養殖動物的免疫力，降低發病率，是實現生態養殖的重要途徑。目前，研究應用的益生菌主要有芽孢桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、霉菌、光合細菌、硝化細菌、反硝化細菌等。但是，復合益生菌對水產動物免疫和抗力方面的研究較少。胡毅等［1］用復合益生菌和單一益生菌投喂凡納濱對蝦，結果發現復合組的特定生長率、飼料效率、溶菌酶活力、血清蛋白濃度等均優于單一菌組。筆者對復合益生菌對刺參免疫和抗病力的影響進行了研究，旨在為其在水產養殖中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復合益生菌。試驗所用的復合益生菌，由大連陽光白奧科技有限公司生產，由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，106CFU/g以上)、乳酸桿菌(Lactobacilli acidophilus，106CFU/g以上)、酵母菌(Saccharomyces，106CFU/g以上)組成。

1.1.2 試驗動物。試驗所用刺參來自大連水益生海洋生物科技公司的同一批次刺參苗，刺參購回后暫養馴化1周。挑取個體大小均勻的健康刺參隨機分為5組，每組3個重復，每個重復30頭刺參，試驗刺參初始體重為(1.07±0.02)g。

1.1.3 試驗地點。養殖試驗在大連海洋大學遼寧省水生生物學重點實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料。試驗飼料配方和營養成分見表1～2。分別在基礎飼料中添加 0、0.2%、0.4%、0.6% 和 0.8% 的復合益生菌，制成A、B、C、D、E 5種飼料。在低于20℃室內陰干后貯存于－20℃的冰箱中待用。

1.2.2 飼養管理。每天以刺參體重的3%投餌，根據攝食情況適當調整飼喂量，達到飽食投喂。每天17:20投喂1次，次日13:30吸除殘餌和糞便，并補充暫存1 d的沙慮海水。飼養期間連續充氣，水溫控制在(15±3)℃。養殖試驗持續8周。

1.2.3 攻毒試驗。攻毒試驗使用黃海希瓦氏菌(Shewanella smarisflavi)，為刺參“化皮病”的致病菌之一，菌液由大連海洋大學病害實驗室免費提供。用復合益生菌養殖刺參8周 后，每頭刺參腹腔注射0.1 ml 6×108CFU/ml的菌液。

表1 試驗飼料組成%

表2 試驗飼料的營養水平 %

1.2.4 體腔液的采集。分別在攻毒第6天和第10天采集刺參體腔液。每個水槽中隨機抽取刺參，用濾紙吸去體表水分后，用無菌、預冷的手術剪從刺參腹部近口1/3處剪開腹腔，將體腔液接收到預冷的離心管中，于4 000 r/min離心15 min，移出上清，分裝到無菌Eppendof離心管中凍存于－20℃冰箱中。每頭刺參取0.5～1.0 ml體腔液，將3～4頭刺參的體腔液混合于1支離心管以消除個體差異。

1.2.5 免疫指標的測定。體腔液中酸性磷酸酶(ACP)的活性采用磷酸苯二鈉法［2］測定。堿性磷酸酶(AKP)的活性采用磷酸苯二鈉法測定［2］。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法［2］測定。過氧化氫酶(CAT)的活性采用比色法測定［2］。溶菌酶(LSZ)活性的測定參照 Dan等［3］的方法并加以修改:將溶壁微球菌用PBS緩沖液(pH 6.4)溶解，調整濃度使其在570 nm波長下吸光值0.2～0.3。測定組每300μl菌液加入5μl樣液，對照組以等體積PBS緩沖液代替樣品。混合后在室溫(18℃)孵育30 min，然后冰浴1 h，測定波長570 nm處的吸光值。LSZ活性單位定義:在37℃以每毫升刺參體腔液樣品每分鐘使吸光度降低0.001為一個酶活力單位(U)。

1.2.6 數據處理。數據處理與統計分析用SPSS 17.0統計分析軟件進行，通過ANOVA單因子方差分析和Duncan’s多重檢驗分析平均值、標準差和組間差異顯著性。結果均以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對刺參免疫酶活性的影響 由表3可知，不同添加量的復合益生菌對刺參的AKP和SOD活性無顯著性(P＞0.05)影響;與其它試驗組和對照組相比，0.6%的復合益生菌顯著提高了刺參的ACP活性(P＜0.05)，0.4%、0.6%和0.8%的復合益生菌顯著提高了刺參CAT活性(P＜0.05)，而0.6%和0.8%的復合益生菌則顯著提高了刺參LSZ活性。

表3 復合益生菌對刺參免疫酶活性的影響

2.2 復合益生菌在感染黃海希瓦氏菌前后對刺參免疫酶活性的影響

2.2.1 對刺參酸性磷酸酶(ACP)活性的影響。從圖1可以看出，在攻毒前(0 d)，除D組的刺參ACP活性顯著高于其他組外，其他組的ACP活性沒有顯著差異(P＞0.05)。攻毒后各組ACP活性均呈現先下降后升高的趨勢。攻毒6 d后，E組ACP活性明顯比對照組低(P＜0.05)。攻毒10 d后，C、D、E組ACP活性均極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.2.2 對刺參堿性磷酸酶(AKP)活性的影響。從圖2可以看出，攻毒后的所有組的AKP活性均呈現增高趨勢。在攻毒前、攻毒6 d和攻毒1 0d后，B、C、D、E組AKP活性均有高于對照組，但組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.3 對刺參超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。從圖3可以看出，在攻毒后各組的SOD活性隨時間的延長呈降低的趨勢。但在攻毒6 d、10 d后，各試驗組的SOD活性的對照組沒有顯著差異(P＞0.05)，盡管前者較后者有降低的趨勢。

2.2.4 對刺參過氧化氫酶(CAT)活性的影響。從圖4可以看出，攻毒后各組刺參的CAT活性有隨時間延長而提高的趨勢。但攻毒前后，B、C、D組CAT活性比對照組也有增高的趨勢，但各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖1 益生菌對刺參酸性磷酸酶(ACP)活性的影響

圖2 益生菌對刺參堿性磷酸酶(AKP)活性的影響

圖3 益生菌對刺參超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

圖4 益生菌對刺參過氧化氫酶(CAT)活性的影響

2.2.5 對刺參溶菌酶(LSZ)活性的影響。從圖5可以看出，攻毒前各組LSZ活性隨著益生菌添加量的增加而逐漸升高，其中D、E組LSZ活性顯著高于A組(P＜0.05)。攻毒6 d后，各試驗組的LSZ活性均比對照組增加，但組間差異不顯著(P＞0.05)。攻毒10 d，各組的LSZ活性無顯著差異(P＞0.05)。

3 結論與討論

圖5 益生菌對刺參溶菌酶(LSZ)活性的影響

該試驗結果表明在基礎飼料中添加復合益生菌可以提高刺參的非特性免疫能力，添加量以6 g/kg飼料為宜。該研究為這種復合益生菌制劑在水產養殖上的應用開辟了廣闊的前景。

3.1 復合益生菌對刺參體腔液中免疫酶活性的影響 無脊椎動物的免疫系統并不健全，主要通過非特異性免疫反應提供抗感染能力［4］。張艷婷［5］發現在刺參飼料中添加滅活植物乳桿菌沒有影響刺參的ACP的活性。該試驗結果表明在刺參飼料中添加0.6%的復合益生菌顯著提高了刺參體腔液的ACP活性，而其他添加量則對ACP活性沒有顯著影響。這可能與益生菌的種類以及添加量有關。

一些研究表明飼料中添加益生菌對水產動物的AKP活性的影響并不一致。袁豐華［6］研究表明在飼料中添加1010CFU/kg凝結芽孢桿菌或108CFU/kg光合細菌對尖吻鱸血液中的AKP活性沒有影響。張艷婷［5］研究表明在飼料中添加高劑量的滅活乳桿菌能夠提高刺參AKP的活性。該研究中添加復合益生菌沒有顯著增強刺參體腔液中AKP的活性。這表明益生菌對刺參等水產動物AKP的影響既與動物的種類有關，也與益生菌的添加量有關。

該試驗中在飼料中添加復合益生菌對刺參體腔液中SOD活性沒有顯著影響。這與袁豐華［6］在尖吻鱸以及張艷婷［5］在刺參上的研究結果類似，而與王國霞等［7］在凡納濱對蝦上的研究結果有所不同。這可能與益生菌的種類和添加量均有關，其具體原因有待進一步研究。

關于益生菌對水產動物過氧化氫酶(CAT)的影響鮮見報道。該試驗中投喂復合益生菌組的刺參體腔液中過氧化氫酶活性與對照組沒有顯著差異。

大量研究表明，益生菌可以提高水生動物的溶菌酶水平［5，8］。該研究中在刺參飼料中添加 0.6%和 0.8% 的復合益生菌可以顯著提高刺參體腔液中的LSZ活性，這與上述研究結果基本一致。

3.2 復合益生菌對希瓦氏菌攻毒的刺參體腔液中免疫酶活性的影響 “化皮病”是目前流行最嚴重的、常導致刺參大量死亡的疾病，而黃海希瓦氏菌是引起大連地區刺參化皮病的重要病原菌［9］，這也是該試驗中采用希瓦氏菌對刺參攻毒的重要原因。

該試驗中攻毒6 d后，各組ACP活性均有所下降，添加0.8%益生菌的處理組ACP活性比對照組低。在攻毒10 d后，ACP活性恢復到攻毒前的水平，但添加高劑量益生菌組的刺參ACP水平也均比對照組顯著降低。這表明高劑量益生菌會抑制刺參體腔液中ACP的活性。這與張艷婷［5］的結果并不一致，其原因有待進一步探討。

該試驗中攻毒后刺參體腔液AKP活性也發生變化。攻毒后的所有組的AKP活性均呈現增高趨勢。在攻毒前、攻毒6 d和攻毒10 d后，B、C、D、E組AKP活性均有高于對照的組。劉洪展［10］用假交替單胞菌感染仿刺參，在5 d內體腔液AKP活性逐漸降低，此后急劇上升，與該試驗攻毒后的酶活性變化趨勢相似。

該試驗中在攻毒后各組的SOD活性隨時間延長而呈降低的趨勢。但在攻毒6 d、10 d后，各試驗組的SOD活性較對照組沒有顯著差異，這與張艷婷［5］的結果類似。張艷婷［5］研究表明添加滅活植物乳桿菌對攻毒后的刺參SOD活性無影響。

該試驗中人工感染黃海希瓦氏菌后，刺參體腔液CAT活性在第6天與攻毒前沒有太大變化，而在第10天整體增強，且益生菌組有高于對照組的趨勢。這說明致病菌感染激發了刺參CAT的活性，且益生菌對刺參過氧化氫酶活性有促進作用。

該試驗中投喂復合益生菌能顯著刺參體腔液中LSZ的活力。攻毒6 d、1 0d后，各試驗組LSZ活性沒有顯著差異，且隨著時間延長而呈降低的趨勢。李明［11］分別用梅奇酵母和芽孢桿菌投喂刺參，發現在第3、4周試驗組的刺參體腔上清液溶菌酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，與該試驗結果相似。在感染黃海希瓦氏菌后，溶菌酶活性較攻毒前整體下降。這說明體腔液中溶菌酶的活性比較容易受到致病菌感染的抑制，免疫功能容易遭到破壞。攻毒6 d后，益生菌組的溶菌酶活性仍高于對照組，說明益生菌能夠適當減少這種損害，使酶活性在相對較高的水平。劉洪展［10］用假交替單胞菌感染仿刺參后，體腔液溶菌酶的活力在短暫升高后顯著降低，與該試驗結果相一致。

［1］胡毅，譚北平，麥康森，等.飼料中益生菌對凡納濱對蝦生長、腸道菌群及部分免疫指標的影響［J］.中國水產科學，2008，15(2):244 －251.

［2］桂遠明.水產動物機能學實驗［M］.北京:中國農業出版社，2004.

［3］DAN H，HAKAN S，TORGNY R，et al.Insect Immunity:Purification and Properties of Three Inducible Bactericidal Proteinsfrom Hemolymph of Immunized Pupae of Hyalophoracecropia［J］.European journal of chemibiology，1980，106:7 －16.

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［5］張艷婷.熱滅活乳酸桿菌(HKLP)對刺參(Apostichopus japonicus)生長性能、消化酶活性、免疫力以及人工感染燦爛弧菌后免疫反應的影響［D］.大連:大連海洋大學，2012.

［6］袁豐華.飼喂益生菌對尖吻鱸生長、消化、免疫及血液生理生化影響的研究［D］.湛江:廣東海洋大學，2009.

［7］王國霞，黃燕華，周曄，等.乳酸菌對凡納濱對蝦生長性能、消化酶活性和非特異性免疫的影響［J］.動物營養學報，2010，22(1):228 －234.

［8］溫俊.復合益生菌與酵母培養物對牙鲆(Paralichthy solivaceus)生長、免疫及抗病力的影響［D］.青島:中國海洋大學，2007.

［9］LI H，QIAO G，LI Q，et al.Biological characteristics and pathogenicityofa highly pathogenic Shewanella marisflavi infectedseacucumber(Apostichopus japonicus)［J］.JFish Dis，2010，33:865 －877.

［10］劉洪展.養殖仿刺參對環境因子和病原的免疫應答及抗病分子機理［D］.青島:中國海洋大學，2012.

［11］李明.混合益生菌對刺參生長、免疫、消化和腸道菌群的影響［D］.大連:大連海洋大學，2014.