皮膚墨水微生物限度檢查方法的驗證

陳飛 王曉青

皮膚墨水(skin marking ink)，又稱劃痕液，是《中國醫院制劑規范》收載的品種，用于皮膚劃線，示病灶范圍，以便治療［1］。現行標準中未收載微生物限度檢查方法，且未見相關文獻報道。該品種含有間苯二酚、苯酚、乙醇等成份、具有一定的抑菌能力。如采用常規法檢查微生物限度，抑菌成分對檢定有影響，可能顯示假陰性結果。為有效控制制劑質量，本文根據《中國藥典》(2010年版二部附錄Ⅺ J)相關規定［2］，參考相關的研究［3］，對皮膚墨水的細菌、霉菌及酵母菌的細菌計數和控制菌檢查方法進行了驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Mettler AE240型電子天平(美國梅特勒-托力多公司);LRH-250F型生化培養箱(上海一恒科技有限公司);LMO2012A511立式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司);SW-CJ-IFD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 樣品 皮膚墨水(長海醫院1批，批號:130628;自制2 批，批號:131106，131111)。

1.4 培養基及稀釋劑 膽鹽乳糖培養基(批號:1211222)、改良馬丁培養基(批號:1210232)、改良馬丁瓊脂培養基(批號:1110272)、營養瓊脂培養基(批號:110310)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號:110224)、營養肉湯培養基(批號:120416)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號:120416)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基(批號:121124)，均為北京三藥科技開發公司生產，靈敏度試驗符合中國藥典規定。pH值7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液(批號:120709)、0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業有限公司，批號:13041213602)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取經35℃培養24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌肉湯培養物，經25℃培養48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物，加入0.9%無菌氯化鈉溶液逐級稀釋至50～100 cfu/ml的菌懸液，備用。取經25℃培養1周的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養物，加入0.9%無菌氯化鈉溶液適量，洗下霉菌孢子，采用管口帶有薄無菌棉花的吸管吸出菌液，轉移至另一無菌試管，標準比濁后用0.9%無菌氯化鈉溶液逐級稀釋至孢子數約為50～100 cfu/ml的孢子懸液，備用。

2.2 供試液制備 取供試品10 ml，加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 微生物計數方法驗證

2.3.1 試驗組:取供試液1 ml過濾，用pH值7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液700 ml分7次沖洗濾膜(每次100 ml)，在最后一次沖洗液中加入上述稀釋的5種菌的菌懸液1 ml(50～100 cfu)，過濾，取出濾膜，貼于營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基表面，分別置30～35℃培養48 h和23～28℃培養72 h。

2.3.2 菌液組:取pH值7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，加入菌液 1 ml，過濾，取出濾膜，其余操作同“2.3.1”項下，測定所加入的試驗菌數。

2.3.3 供試品對照組:取供試液 1 ml，按“2.3.1”項下方法過濾沖洗，不加菌懸液，測定供試品本底菌落數。

2.3.4 稀釋劑對照組:用相應的稀釋液替代供試品，其余操作按“2.3.1”項下方法進行。

2.4 控制菌檢查驗證

2.4.1 試驗組:取1∶10的供試液10 ml過濾，用 pH值7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液700 ml分7次沖洗，在最后一次沖洗液中分別加入10～100 cfu的金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌，取出濾膜，接入相應的100 ml營養肉湯培養基或膽鹽乳糖培養基(BL)中，置30～35℃培養箱培養18～24 h，取上述培養物分別劃線培養于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，觀察是否有典型菌落生長。

2.4.2 陰性菌對照組:取稀釋液10 ml，以大腸埃希菌為對照菌株，按試驗組方法操作，相同條件下培養。

2.5 計數方法驗證結果 按方法項對3個批號的供試品微生物限度進行驗證，試驗結果見表1。結果表明采用薄膜過濾法檢查皮膚墨水的細菌數、霉菌及酵母菌數，用700 ml沖洗液分7次沖洗，可消除供試品內抑菌成分的影響，試驗組和稀釋劑對照組的回收率均在70%以上，符合驗證要求。

表1 微生物計數方法驗證的回收率結果 n=3

2.6 控制菌檢查驗證結果 采用薄膜過濾法進行驗證，陽性對照菌可檢出，陰性對照菌未檢出，按本薄膜過濾法進行控制菌檢查方法可行。見表2、3。

表2 金黃色葡萄球菌檢查驗證結果

表3 銅綠假單胞菌檢查驗證結果

2.7 樣品測定 根據上述試驗結果，采用薄膜過濾法對三批樣品進行細菌、霉菌和酵母菌計數和控制菌的檢查，該方法可用于皮膚墨水的微生物限度檢查。見表4。

表4 3個批號樣品微生物限度檢驗結果

3 討論

皮膚墨水中含有的間苯二酚、苯酚，具有較強的消毒防腐作用，溶媒也有一定比例的乙醇，采用常規法進行細菌計數的檢查時，樣品對細菌、霉菌、酵母菌均有一定的抑制作用，微生物計數方法的回收率結果不能符合要求。薄膜過濾法是消除藥品中抗菌活性的最有效方法［4］，因此本文采用該方法用于皮膚墨水的微生物檢查。對沖洗液用量的考察結果表明，需要較大量的沖洗液來消除處方中抑菌成分的影響，但是過大的沖洗液會損傷薄膜，導致回收率不合格，故最終選取了700 ml的沖洗液分7次沖洗來消除抑菌成分的影響。

微生物限度檢查是藥品質量標準中重要的一項內容，越來越受到重視。我國藥典目前是按劑型規定了微生物限度標準，《中國醫院制劑規范》亦采用劑型分類方法規定微生物限度標準。但醫院制劑各生產單位的檢驗條件參差不齊，在實際操作中，各自建立微生物限度檢查方法并進行方法驗證較為困難。因此，有必要對不同單位生產的同一制劑品種制訂統一的檢驗方法，這將有助于提高醫院制劑整體的生產和檢驗水平。

1 中華人民共和國衛生部藥政局主編.中國醫院制劑規范.中國醫藥科技出版社，1995.17.

2 國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典(二部).中國醫藥科技出版社，2010.附錄 XI J 107-116.

3 孫玫，郭蓮榮，季嬌.乳核內消膠囊微生物限度檢查方法驗證.實用藥物與臨床，2010，13:200-202.

4 光新蘭，張洪，戴鵬飛.薄膜過濾法在藥品檢驗中的應用.醫藥導報，2006，25:253-254.