針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體通路研究進展

樊海龍 趙 凌 任玉蘭 梁繁榮

(成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，成都，610075)

針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體通路研究進展

樊海龍 趙 凌 任玉蘭 梁繁榮

(成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，成都，610075)

目的：探討針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體細胞信號轉導機制，為后續(xù)研究提供思路。方法:通過對近年來國內外有關線粒體心臟損傷的研究入手，分析針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體通路的研究進展。結果：研究多以大鼠為觀察對象，主要從針刺改善線粒體功能，減少線粒體活性氧類(ROS)產(chǎn)生過量引起氧化應激，防止細胞內Ca2+超載和阻止線粒體通透性轉換孔(mPTP)的開放等角度切入研究。結論：微小RNA(microRNA，miRNA)是基因網(wǎng)絡、蛋白網(wǎng)絡、代謝網(wǎng)絡等的上游網(wǎng)絡的調控環(huán)節(jié)。鑒于針灸作用的整體性特點，將miRNA引入針灸作用機制研究領域，可在基因或其他水平層面更好地揭示針灸作用機制。

針灸；心肌缺血再灌注損傷；線粒體功能障礙；線粒體通路；細胞信號轉導

據(jù)統(tǒng)計，1990年全球有超過520萬人(n=5,211,790)死于缺血性心臟病(Ischaemic Heart Disease,IHD)，2010年則有超過700萬人(n=7,029,270)，增長了35%[1]。近年來，IHD的治療隨著動脈搭橋術、溶栓療法、經(jīng)皮腔內冠脈血管成形術以及體外循環(huán)心臟外科手術等的推廣應用，心肌缺血再灌注損傷已成為臨床普遍關注的問題。針灸對心肌缺血再灌注損傷的保護作用已被越來越多的實驗研究所證實，我們在本文主要從線粒體心臟損傷作用機制入手，對針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體通路作一點滴探討。

1 心肌缺血再灌注損傷的線粒體能量代謝障礙機制

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI)常見于急性心肌梗死后的復灌治療，表現(xiàn)為心律失常和心臟舒縮功能降低，這與心肌能量代謝障礙、微血管損傷及心肌細胞凋亡有關；其中線粒體能量代謝障礙是引起MIRI的重要因素[2]，主要機制包括線粒體三磷酸腺苷(ATP)生成減少并產(chǎn)生過量的活性氧類(ROS)引起氧化應激、Ca2+超載和線粒體通透性轉換孔(mPTP)持續(xù)性開放[3]。線粒體是缺血再灌注眾多炎癥因子激活的各種細胞通路的重要靶作用部位，缺血預處理(Ischemic Preconditioning,IPC)主要機制就是阻斷一些炎癥因子激活細胞通路，從而達到保護線粒體功能進而減輕心肌細胞損傷的目的。線粒體心臟損傷作用主要通過以下四點實現(xiàn):ATP合成減少；ROS；Ca2+超載；mPTP。

1.1 ATP合成減少 心肌缺血使線粒體氧化磷酸化受阻，進而使ATP生成減少。ATP的不足使一些ATP依賴酶類功能障礙，其中最顯著的就是Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)，它是維持細胞內離子平衡最重要的酶。當ATP生成障礙時，細胞內的Na+無法被泵出，濃度不斷升高；再灌注時細胞外pH值快速恢復使細胞內外形成顯著的pH值梯度，這將激活肌膜Na+/H+交換蛋白(NHE)引起Na+大量內流。細胞內Na+異常增多(Na+超載)會激活Na+/Ca2+交換蛋白(NCX)的反向模式轉運導致大量Ca2+進入細胞，從而引起或加重心肌鈣超載[3-4]。故增強Na+-K+-ATPase活性，以維持膜內外環(huán)境的穩(wěn)定，保護線粒體及心肌對防治心臟缺血再灌損傷具有重要意義。

1.2 ROS 線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源，也是ROS的主要靶目標。缺血心肌再灌注時產(chǎn)生過量的ROS是引起MIRI的主要原因，而線粒體是心肌缺血再灌注過程中產(chǎn)生ROS的重要來源。當線粒體抗氧化酶包括谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等的抗氧化能力降低或線粒體ROS生成增多時，就會導致氧化應激。氧化應激不僅抑制線粒體呼吸酶活性，減慢呼吸鏈的電子傳遞，增加ROS產(chǎn)生；還可以上調解偶聯(lián)蛋白(UCPs)表達[5]。過度的UCPs表達是介導氧化應激引起線粒體功能障礙的效應分子。氧化應激致使線粒體功能障礙，引發(fā)鏈式脂質過氧化反應，損害線粒體膜的通透性，引起電子傳遞鏈酶活性的進一步下降，進而形成惡性循環(huán)，最終造成心肌細胞凋亡和壞死[6]。因此，抗氧化應激是防治MIRI的重要手段。

1.3 Ca2+超載 線粒體對心肌細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的調節(jié)發(fā)揮關鍵作用，而線粒體對Ca2+的吸收受Ca2+單向轉運體(uniporter)的調節(jié)。正常情況下，心肌細胞肌質網(wǎng)/內質網(wǎng)(SR/ER)Ca2+釋放位點附近分布有豐富的線粒體，可通過Ca2+單向轉運體捕獲大量的Ca2+，該轉運機制僅通過線粒體膜電位(ΔΨm)來驅動，不與其他離子交換或共轉運。線粒體Ca2+濃度對細胞質Ca2+的迅速回應是通過NCX和H+/Ca2+交換蛋白(HCX)實現(xiàn)的，二者分別通過Na+和H+進入線粒體驅動Ca2+的排出，維持線粒體基質、細胞質和SR/ER的內鈣穩(wěn)態(tài)。然而，當Ca2+單向轉運體攝入的Ca2+濃度增加至NCX活力被飽和時，就會導致線粒體Ca2+超載，從而觸發(fā)mPTP開放。mPTP開放會引起線粒體膜電位崩潰、呼吸鏈解偶聯(lián)、細胞色素C及其他促凋亡因子釋放、ATP耗竭，這些代謝變化最終導致心肌細胞凋亡[7]。有研究表明，當心肌缺血-再灌注時，肌細胞內Ca2+嚴重過載，于是約占35%細胞容積的線粒體暫時吸收大量的Ca2+，從而抑制過度收縮、Ca2+依賴性蛋白酶(又稱“需鈣蛋白酶”)激活和心律失常[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌心臟MicroRNA-214通過抑制編碼Na+/Ca2+交換蛋白的mRNA表達，調節(jié)細胞鈣內流，并抑制鈣介導的細胞死亡信號通路，發(fā)揮細胞保護作用[9]。這些研究結果提示，調控線粒體內Ca2+超載可能是防治MIRI的靶點之一。

1.4 mPTP mPTP是線粒體膜上連接細胞質與線粒體內部的孔道，它介導了線粒體和細胞基質的物質及信號交流。在MIRI中，ROS本身也可以誘導線粒體產(chǎn)生更多的ROS，這一現(xiàn)象稱之為ROS誘導的ROS釋放(RIRR)，RIRR是在過度氧化應激等條件下觸發(fā)mPTP持續(xù)性開放，mPTP持久開放使大量小分子進入線粒體，造成線粒體腫脹和外膜破裂膜電位崩潰，同時mPTP的持續(xù)性開放狀態(tài)使游離的B細胞淋巴瘤因子相關X蛋白(Bax)[10]移位到線粒體膜與B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)結合[11]，阻止Bcl-2的激活，Bax和Bcl-2表達的比例決定細胞是生存還是凋亡[12]。另有研究表明，非Ca2+依賴型蛋白激酶C-δ(nPKC-δ)在心肌再灌注開始5 min時快速進入線粒體，導致超氧陰離子產(chǎn)生增多，線粒體功能喪失以及加強了細胞色素C的釋放和激活下游促凋亡因子[13]。nPKC-ε的易位對缺血心肌保護效應的啟動起到了十分重要的作用，其主要的作用是抑制了mPTP的開放[14]，進而減少心肌梗死面積。關閉mPTP可作為治療MIRI的靶標之一[15]。

2 線粒體ATP敏感性鉀通道在IPC心肌保護中的作用

ATP敏感鉀離子通道(KATP通道)分為兩種：一是位于細胞膜上的KATP通道(sarcKATP)；二是位于線粒體膜上的KATP通道(mitoKATP)。目前，IPC可以開放線粒體mitoKATP，阻止mPTP開放而發(fā)揮預處理作用[16]。mitoKATP開放劑二氮嗪[17]、尼可地爾[18]等均可模擬這種預處理的心肌保護作用[19]。Sasaki等[20]，在大鼠離體心臟模型和兔心肌細胞模型中發(fā)現(xiàn)，MCC-134，一種sarcKATP開放劑和mitoKATP抑制劑，可以明顯消除IPC的心肌保護作用，說明mitoKATP在IPC心肌保護中發(fā)揮主導作用。研究表明一氧化氮(NO)介導IPC的延遲保護，在清醒兔應用一氧化氮合酶抑制劑可取消IPC的延遲保護[21]，NO是延遲相預適應心肌保護終未效應器mitoKATP通道的激活物[22]，活化的mitoKATP能減少線粒體膜電位喪失，從而防止線粒體鈣超載及mPTP開放，從而達到心肌保護作用。

3 針灸防治MIRI的線粒體細胞信號轉導機制

3.1 針灸對Na+-K+-ATPase的影響 心肌缺血使線粒體氧化磷酸化受阻，ATP生成減少，可使心肌膜上Na+-K+-ATPase活性下降，促使細胞內Ca2+明顯增多，加重鈣超載，并且細胞內H+增多，加重心肌細胞損傷。嚴潔等[23]采用冠狀動脈結扎法建立心肌缺血再灌注模型大鼠。無機磷比色法測定缺血中心區(qū)心肌組織細胞膜鈉泵活性，用RT-PCR法分析鈉泵的基因表達。結果顯示:缺血再灌注損傷后，心肌組織Na+-K+-ATPase mRNA表達下調，Na+-K+-ATPase活性降低，電針內關后可上調Na+-K+-ATPase mRNA表達，增強Na+-K+-ATPase活性。說明電針內關可能通過上調心肌細胞膜鈉泵基因表達、增強鈉泵活性，以維持膜內外環(huán)境的穩(wěn)定，保護心肌。

3.2 針灸對mitoKATP的影響 心肌缺血性損傷時cNOS mRNA呈低表達，一氧化氮合酶(NOS)活性降低，心肌NO的合成和釋放減少，血清NO濃度下降[24]。NO是mitoKATP通道的激活物，mitoKATP通道激活能減少線粒體膜電位喪失，從而防止線粒體鈣超載及mPTP開放，從而達到心臟保護作用。宋春華等[25]電針心俞穴30 min，血清NO含量電針預處理組顯著高于模型組(P<0.01)。王超等[26]采用冠脈結扎法建立心肌缺血再灌注模型大鼠，電針內關穴20 min，硝酸還原酶比色法檢測各組心肌組織NO、NOS的含量，結果顯示：電針內關穴組與模型組比較，心肌組織NO、NOS含量明顯升高(P<0.05)。針灸內關穴預處理提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量[27]，即可以增強延遲性保護機制的細胞信號轉導通路中觸發(fā)物質NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明針灸預處理內關穴可以在48 h這一延遲時相產(chǎn)生針對缺血再灌注損傷心肌的保護作用。可見，針灸對心肌保護作用，可能通過增加NOS活性使NO合成和釋放增多，激活mitoKATP通道實現(xiàn)的。

3.3 針灸的抗氧化應激 超氧化物歧化酶(SOD)為超氧陰離子自由基清除酶，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)為過氧化氫清除酶，它們?yōu)檠踝杂苫闹饕宄?，通過與自由基反應生成穩(wěn)定的基團而將其清除，保護細胞免受損傷[28]。過氧化氫酶(CAT)主要同細胞內線粒體與過氧體結合，能迅速分解細胞代謝中產(chǎn)生的毒性物-H2O2，進而減少自由基的生成。它和SOD、GSH-Px構成人體重要的抗氧化酶系統(tǒng)，三者協(xié)同作用以減少活性氧基的產(chǎn)生，防止脂質過氧化及其中間代謝產(chǎn)物對機體的損害,具有十分重要的生理功能。測定CAT、SOD和GSH-Px活性間接反映了機體抗氧化損傷和清除自由基的能力。宋春華等[25]電針心俞穴30 min，血清CAT含量電針預處理組顯著高于模型組(P<0.01)。林亞平等[29]采用冠脈左前降支結扎法造成心肌缺血模型家兔。用754紫外分光光度計檢測SOD、GSH-px。結果顯示:在缺血再灌注40 min后，模型組心肌組織中SOD、GSH-px明顯降低，而缺血處理組、電針內關組可拮抗SOD、GSH-px降低，與模型組比較P<0.01或P<0.05。說明心肌缺血預處理與電針內關通過提高內源性氧自由基清除系統(tǒng)酶的活性，抑制缺血再灌注心肌細胞膜脂質過氧化反應，對缺血再灌注心肌具有明顯的保護作用。

3.4 針灸對Ca2+超載的調控 鈣網(wǎng)蛋白(CRT)屬于KDEL(作為內質網(wǎng)滯留信號的四肽序列)蛋白家族，參與Ca2+穩(wěn)態(tài)、抗原遞呈、細胞凋亡[30]。CRT過表達可抑制腎上皮LLC-PK細胞內質網(wǎng)Ca2+釋放，減輕胞漿鈣超載，增強細胞抗氧化應激能力[31]，從而抑制線粒體通過Ca2+單向轉運體對Ca2+的吸收，阻止線粒體內Ca2+超載。王超等[26]在Fluo-3/AM染色后于激光共聚焦顯微鏡下檢測缺血再灌注損傷心肌細胞內Ca2+熒光強度，電針內關穴組明顯低于模型組(P<0.01)，說明針刺對缺血再灌注損傷心肌細胞內Ca2+超載具有抑制作用。袁葉等[32]采用冠脈結扎法建立心肌缺血再灌注模型大鼠，隨機分為假手術組、缺血再灌注模型組、針刺內關治療組、針刺郄門治療組和針刺合谷對照組，針刺上述穴位20 min，腹腔靜脈取血并摘取心臟，采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定血清CRT含量及免疫組化染色檢測心肌組織CRT基因表達，結果顯示：針刺內關及郄門治療組血清CRT含量明顯升高，心肌組織CRT基因表達呈高表達狀態(tài)，與缺血再灌注模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；針刺合谷對照組與缺血再灌注模型組近似(P>0.05)。田岳鳳等[33]觀察針刺內關對心肌缺血再灌注損傷線粒體超微結構的影響，發(fā)現(xiàn)模型組肌絲溶解，線粒體水腫，嵴數(shù)目明顯減少，線粒體嵴致密變性；而針刺內關組肌纖維排列較整齊，線粒體基本正常，嵴數(shù)目增多，大多數(shù)呈板層狀形態(tài)，僅見部分輕度水腫。說明針刺手厥陰經(jīng)穴可明顯提高體內CRT含量，促進CRT基因表達的上調，抑制Ca2+超載，減輕線粒體超微結構的病理變化，對缺血再灌注心肌具有保護作用。

3.5 針灸抑制mPTP的開放 Bcl-2是第一個被發(fā)現(xiàn)參與凋亡調控的基因家族，mPTP的開放使Bax與Bcl-2結合，阻止Bcl-2的激活，Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡，從而促進凋亡?？姿仄降萚34]，采用結扎左冠狀動脈前降支法建立心肌缺血再灌注模型大鼠。隨機分為假手術組、模型組、電針夾脊組、電針內關組、電針陽陵泉組，電針上述穴位20 min。采用TUNEL法檢側心肌細胞凋亡，免疫組化法檢側Bcl-2及Bax表達。結果顯示：電針夾脊組、電針內關組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達均顯著升高(P<0.01)，而Bax蛋白表達顯著下降(P<0.01)；細胞凋亡指數(shù)(AI)顯著下降(P<0.01)。說明電針夾脊穴、內關穴均對缺血再灌注損傷心肌有明顯的保護作用，其機制可能與通過抑制mPTP的開放，阻止Bax與Bcl-2結合，激活Bcl-2蛋白，從而抑制細胞凋亡。

此外，有研究表明心肌線粒體縫隙蛋白Cx43參與保護兔心肌缺血/再灌注損傷[35-36]。針灸“內關”穴預處理可使缺血再灌注心肌細胞Cx43表達升高，參與心肌電藕聯(lián)和代謝藕聯(lián)來保護心肌細胞[37]。

4 展望

綜上所述，改善線粒體功能，減少線粒體ROS產(chǎn)生過量引起氧化應激，防止細胞內Ca2+超載和阻止線粒體mPTP的開放均是針灸防治MIRI的作用機制。在脊椎動物，細胞凋亡途徑主要由內源性途徑(線粒體途徑)介導，線粒體mPTP開放使細胞色素C(Cyto-c)，細胞凋亡蛋自酶激活因子(Apaf-1)等釋放，通過半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)激活和死亡效應物生成，最終引起細胞死亡[38]。Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9等為微小RNA(microRNA，miRNA)調節(jié)內源性途徑介導的細胞凋亡的主要相關蛋白；NO、mKATP及mPTP均是miRNA的作用靶點[39]。miRNA是基因網(wǎng)絡、蛋白網(wǎng)絡、代謝網(wǎng)絡等的上游網(wǎng)絡的調控環(huán)節(jié)[40]，廣泛參與生物體的生長發(fā)育及各種病理生理過程，是打開基因調控機制的新窗口[41-42]。鑒于針灸作用的整體性特點，將miRNA引入針灸作用機制研究領域，可在基因或其他水平層面更好地揭示針灸作用機制，必將為針灸防治MIRI機制研究提供更廣闊的空間。

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(2015-03-02收稿 責任編輯：洪志強)

Acu-moxibustion Prevention and Control of Injured Mitochondrial Pathway due to Myocardial Ischemia-Reperfusion

Fan Hailong, Zhao Ling, Ren Yulan, Liang Fanrong

(CollegeofAcupuncture-MoxibustionandTuina,ChengduUniversityofTCM，Chengdu610075,China)

Objective:To investigate acu-moxibustion protection of mitochondrial cellular signal transduction dysfunction due to myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods:The research was made by studying research results published in recent years.Results:Most research used rats as study subjects and found acupuncture can improve mitochondria function, reduce mitochondrial reactive oxygen species (ROS) which caused excessive oxidative stress, prevent the intracellular Ca2+overload and the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) open.Conclusion:MicroRNA (miRNA) is the control factor of such upstream networks as genetic networks, protein networks, and metabolic networks. Given the overall characteristics of acupuncture effect, introducing the miRNA into the acupuncture mechanism research can better reveal acupuncture mechanism.

Acu-moxibustion; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Mitochondrial dysfunction; Mitochondrial Pathway; Cellular signal transduction

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號：2012CB518501)；國家自然基金面上項目(編號：81373561)；四川省科技廳項目(編號：2011SZ0302)；成都市科技計劃項目(編號：12DXYB215JH-002)

樊海龍(1977—)，男，博士研究生在讀，研究方向：經(jīng)穴效應循經(jīng)特異性規(guī)律及關鍵影響因素基礎研究，E-mail:zjfhl1977@163.com

梁繁榮(1956—)，男，教授，博士生導師，研究方向：經(jīng)穴效應特異性規(guī)律的臨床與基礎研究，E-mail：acuresearch@126.com

R245-0

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10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.006