魚藤酮誘導制備SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鮑波，葉成，利慧華，朱少平，曾敏娟

(廣東醫學院，廣東湛江524000)

魚藤酮誘導制備SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鮑波，葉成，利慧華，朱少平，曾敏娟

(廣東醫學院，廣東湛江524000)

目的 采用長期低劑量皮下注射魚藤酮的方法制備SD大鼠帕金森病模型。方法 將36只SD大鼠隨機分為實驗組24只和對照組12只，實驗組給予l.5 mg/(kg·d)魚藤酮皮下注射，對照組注射等體積葵花油，連續30 d，每周停藥1 d。給藥結束后進行行為學測試，并斷頭取腦，采用免疫組化SP法檢測中腦黑質多巴胺能神經元數目。結果 對照組行為學改變不明顯，其黑質多巴胺能神經元數目較多；實驗組出現明顯的行為學改變，其黑質多巴胺能神經元數目減少，符合PD的診斷標準。結論 頸背部皮下注射魚藤酮可成功制備SD大鼠帕金森病模型。

帕金森病；魚藤酮；大鼠；TH陽性細胞

帕金森病(PD)是一種以中腦黑質致密部多巴胺能神經元退行性變為主要病理特征的慢性神經系統疾病。2012年8月，我們對SD大鼠長期低劑量皮下注射魚藤酮，觀察其行為學變化、腦黑質中酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞病理變化及細胞數量的改變，據此建立魚藤酮誘導的SD大鼠帕金森病模型，為臨床預防和治療PD奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級健康成年雄性SD大鼠36只，體質量180～200 g，由廣東醫學院實驗動物中心提供。使用標準飼料飼養于溫度20～22 ℃、濕度45%～65%、光照12 h明暗交替環境中，自由攝食、攝水。魚藤酮(美國Sigma)，TH小鼠單克隆抗體(CST)，超敏型ABC免疫組化染色試劑盒(福州邁新)，DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠適應性飼養l周后，隨機分為實驗組24只和對照組12只，參考文獻[1，2]方法建立PD模型。實驗組于頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，魚藤酮在葵花油中的濃度為1.5 mg/mL；對照組注射等體積葵花油。每天上午8:00注射，注射前測量動物體質量，每周停藥1次，共30 d。由于魚藤酮具有全身毒性作用，因此給藥期內動物出現四肢不能站立行走、翻身困難、喪失主動進食能力時，立即終止注射，終止注射的大鼠在最后1次給藥1 d后對實驗組進行篩選時根據終止注射的時間選擇納入或排除出后續研究和統計分析。最后1次給藥1 d后對實驗組進行篩選，篩選模型制作成功的標準為：給藥3周以后才開始出現四肢不能站立行走、翻身困難、喪失主動進食能力[3]；拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背，主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫，或有步態不穩[4]。排除死亡和不符合上述要求的大鼠，實驗組共12只進入下一步實驗。

1.2.2 行為學測試 最后1次給藥1 d后對兩組分別進行行為學測試。

1.2.2.1 網格實驗[5]用于檢測大鼠全身僵直情況。將大鼠頭朝上置于一個與水平面垂直的獨立金屬網格(長80 cm、寬50 cm、格間距1 cm)的中央，使其趾爪均抓住金屬網格，并保證在此位置上大鼠無法抓住網格邊緣或其他附帶物，放置大鼠的同時用秒表記時，記錄大鼠由靜止狀態至任意一爪移動所間隔的時間，即為移動潛伏期。每只大鼠重復測量3次，每次間隔5 min。

1.2.2.2 懸掛實驗 用于檢測大鼠肌張力。將大鼠兩前爪懸掛于水平放置的金屬絲(直徑2 mm、長約30 cm)上，金屬絲距地面1 m，記錄大鼠落地前的時間，如大鼠在3 s內跌落或僅一個爪抓住金屬絲均屬失敗。對懸掛時間進行評分，0～4 s為0分，5～9 s為1分，10～14 s為2分，15～19 s為3分，20～24 s為4分，25～29 s為5分，超過30 s為6分。每只大鼠重復測量3次，每次間隔5 min。

1.2.2.3 跨步實驗[6]用于考察大鼠前肢運動功能。操作者一手固定大鼠軀體后半部和后肢使其離地，另一手固定一側前肢使另一前肢著地，以大鼠正手方向斜向一側移動，5 s內移動90 cm，記錄大鼠移動時著地側前肢跨步數，交替測量兩側上肢的跨步數，取兩側跨步數的總和為最終紀錄結果。

1.2.3 腦標本的制作 行為學檢測完畢后對大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，迅速斷頭取腦，于冰面上快速分離腦組織，冰生理鹽水漂洗，除去腦膜和血液。每組隨機取6只樣本于冰皿上剝離黑質，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋，切片機連續做冠狀切片，其余腦組織分離獲取中腦后稱取質量，-80 ℃保存待用。

1.2.4 TH陽性細胞檢測 采用免疫組化SP法，取石蠟切片，經二甲苯及梯度乙醇脫蠟，加入3% H2O2，PBS浸洗，高壓抗原修復，滴加封閉血清室溫孵育10 min，依次加入一抗(CST，1∶300)、生物素標記的二抗、辣根酶標記的鏈霉卵蛋白工作液孵育，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。先在100倍鏡下選擇TH陽性細胞(其細胞形態較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質內棕色顆粒濃密，部分可見神經突起及其分支)密集區，然后在400倍鏡下計數TH陽性神經細胞個數，每個腦組織黑質部位包塊選4張連續切片，計算平均值。

2 結果

2.1 一般癥狀觀察 對照組毛色光亮，活潑好動，飲食如常，體質量正常增長。實驗組給藥1周后體質量明顯下降，自主活動減少，抗捕捉反應減少，而癥狀最嚴重最突出的時間段多為3～4周。部分大鼠由于行動和攝食能力部分或完全性喪失，體質量下降較快；毛色發黃變臟，動作遲緩，弓背及抓握狀姿勢，四肢僵硬或癱瘓并伴有震顫等癥狀；少數大鼠出現口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，間歇性抽搐和翻滾，甚至完全喪失行動能力，停止注射魚藤酮后多數大鼠癥狀有所減輕，體質量回升，少數大鼠停藥后癥狀持續加重，最終死亡。

2.2 魚藤酮對大鼠行為學的影響

2.2.1 兩組網格實驗結果比較 魚藤酮處理第30天時，實驗組網格實驗反應時間為(4.32±0.72)s，對照組均<1 s，兩組比較有統計學差異(P<0.05)。

2.2.2 兩組懸掛實驗結果比較 魚藤酮處理第30天時，觀察組懸掛實驗評分為(1.42±1.08)分，對照組為(4.08±2.27)分，兩組比較有統計學差異(P<0.05)。

2.2.3 兩組跨步實驗結果比較 魚藤酮處理第30天時，觀察組肢體運動功能明顯減退，跨步實驗前肢跨步數為(17.50±3.58)步，對照組為(27.25±1.65)步。兩組比較有統計學差異(P<0.05)。

2.3 兩組黑質TH陽性神經細胞數比較 免疫組化結果顯示，對照組黑質TH陽性神經細胞數為(115.75±15.06)個，實驗組為(48.83±10.58)個，實驗組TH陽性神經細胞數目顯著下降(P<0.05)。對照組中黑質可見大量規則狀TH陽性細胞和神經纖維，其細胞形態較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質內棕色顆粒濃密，部分可見神經突起及其分支，TH陽性細胞呈特異性條帶型分布。實驗組黑質TH陽性細胞神經元數目明顯減少較多，且細胞染色變淺，著色不均，殘存的TH陽性神經元呈現胞體腫脹、萎縮，神經突起減少或消失的現象，大部分形態已明顯改變，呈三角形或不規則多邊形，并且細胞的輪廓不清晰,顯示神經元進行性退化特征，帶型模糊。

3 討論

建立合適的PD動物模型是開展PD研究的重要內容和工具[7]。目前已經建立的PD動物模型主要有利血平模型、6-OHDA模型、甲基苯丙胺模型、百枯草模型、代森錳模型、MPTP模型、魚藤酮模型、脂多糖模型[8]以及基因敲除與轉基因動物模型[9]等。由于PD多巴胺黑質神經元選擇性丟失的確切機制尚不明確，其模型的建立也一直處于不斷改進當中。

魚藤酮是由醉魚科植物毛魚藤的膠狀液汁提取的化學物質，具有很強的親脂性，能輕易透過血腦屏障進入神經細胞胞質內，并選擇性聚集在線粒體等細胞器，抑制線粒體呼吸鏈復合體I活性，損害氧化磷酸化，進而產生細胞毒性作用。2000年，Betarbet等[5]首次使用魚藤酮成功誘導出PD大鼠模型。研究表明，魚藤酮誘導的PD模型在重現PD疾病行為學變化的同時，其病理學特征同人類PD疾病具有高度的相似性。此外，魚藤酮是一類廣泛分布于自然界的環境毒素，這與PD流行病學調查結果相符。因此，魚藤酮誘導的PD模型在發病機制上可能更接近人類PD的自然進程。但魚藤酮誘導的PD動物模型存在死亡率高、成模率低、操作復雜、成本相對較高等缺點，已報道的PD動物模型研究也多采用小鼠進行。由于PD動物模型的研究涉及黑質紋狀體部位的給藥和取材，黑質紋狀體體積較小，定位困難，相對小鼠而言，大鼠腦部尺寸較大，有利于腦部各區的立體定位，給藥和取材的精確性較高。因此本實驗選用生命力強、抗感染能力好的SD大鼠進行PD模型的制備。

采用魚藤酮制備帕金森病動物模型的給藥方法主要有口服法、皮下注射法、腹腔注射法、微泵靜脈灌注射法和黑質立體定向注射法等[10]。考慮到魚藤酮的全身毒性作用導致的死亡率較高，且小劑量魚藤酮的作用更能體現慢性疾病的致病過程,本實驗中在給藥途徑上采用吸收較緩慢的長期低劑量皮下注射魚藤酮的方法。實驗中觀察到，皮下給藥1周后，魚藤酮給藥組即出現明顯的主動攝食減少，體質量逐漸減輕，部分大鼠由于行動和攝食能力部分或完全性喪失，體質量下降較快。同時可見大鼠毛色發黃變臟、動作遲緩、弓背及抓握狀姿勢、四肢僵硬或癱瘓、并伴有震顫等癥狀。與文獻[1]報道相一致。此外，部分大鼠還出現口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，或有間歇性抽搐和翻滾，甚至完全喪失行動能力，這可能與SD大鼠個體間的差異性有關。

行為學測試表明，經魚藤酮處理第30天魚藤酮處理組網格實驗反應時間明顯長于對照組，表明魚藤酮處理組全身僵直癥狀嚴重；懸掛實驗中，魚藤酮處理組評分降低，提示肌張力增高；跨步實驗結果也表明魚藤酮處理組運動協調性下降明顯。根據上述行為學表現及癥狀等可以初步判斷PD模型復制成功，表明長期頸背部皮下注射魚藤酮的方法復制PD模型是可行的。

本研究對多巴胺能神經元TH陽性細胞進行免疫組化檢測，結果顯示，對照組黑質區可見大量規則狀TH陽性細胞和神經纖維，TH陽性細胞數目為(115.75±15.06)個，其細胞形態較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質內棕色顆粒濃密，部分可見神經突起及其分支，TH陽性細胞在黑質區呈特異性條帶形分布；魚藤酮處理組TH陽性細胞數目明顯減少，染色變淺，著色不均，殘存TH陽性神經元呈現胞體腫脹、神經突起減少或消失的現象。有研究表明，魚藤酮誘導PD模型的機理可能同魚藤酮具有極強的親脂性有關，魚藤酮在不依賴DA轉運體的情況下自由通過血腦屏障和細胞膜并聚集在細胞器如線粒體內，可選擇性抑制線粒體復合物Ⅰ的活性，產生活性氧和釋放凋亡誘導因子，引起氧化應激和細胞凋亡[11]。兩組無論是TH陽性細胞數量還是染色形態等都存在明顯差異，提示魚藤酮處理導致了相應的病理改變，且與魚藤酮處理組顯現的PD行為學改變相一致。

綜上所述，綜合病理癥狀、行為學改變、TH陽性細胞數對建立的PD模型進行評價，表明通過長期低劑量皮下注射魚藤酮制作大鼠PD模型是成功的，可以較好地模擬PD的相關特征，在PD病理機制及藥物對PD的預防、治療研究中具有很好的應用前景。

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[3] 馮媛.魚藤酮帕金森病模型中α-突觸核蛋白聚集機制研究[D].武漢:華中科技大學,2007:1-96.

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[5] Betarbet R, Sherer TB, MacKenzie G, et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease[J]. Nat Neurosci, 2000,3(12):1301-1306.

[6] Chang JW, Wachtel SR, Young D, et al. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions[J]. Neuroscience, 1999,88(2):617-628.

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[10] 王蕾,蘇耀,熊中奎.魚藤酮誘導擬帕金森病鼠科動物模型的研究進展[J].現代預防醫學,2013,(16):3087-3089.

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Establishment of PD models in SD rats induced by rotenone

CHAIXing-xing，BAOBo，YECheng，LIHui-hua，ZHUShao-ping，ZENGMin-juan

(GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524000,China)

Objective To established PD models by long term subcutaneous injection of rotenone. Methods Totally 36 SD rats were randomly divided into two groups: control group contained 12 rats and model building group contained 24 rats. Rats in model building group were treated with rotenone at dose of 1.5 mg/(kg·d) by subcutaneous injection for 30 days, withdrawal one day a week. Rats in control group were treated with the same volume of sunflower oil. After the end of subcutaneous injection, the behavior changes of SD rats were tested and then sacrificing the rats to take out the brain tissues, detecting the expression of TH-positive cells in substantia nigra by counting out the number of TH-positive cells. Results The behavior changes of SD rats in control group were not obvious, but the number of dopaminergic neurons increased. The behavior changes of SD rats in model building group was obvious, and their dopaminergic neurons numbers decreased. SD rats in model building group met the diagnostic criteria of PD. Conclusions The methods of long-term subcutaneous injection of rotenone could establish PD models in SD rats.

Parkinson disease; rotenone; rats; TH-positive cells

廣東省科技計劃項目(2010B060500015)；廣東省科技計劃項目(2013B060300038)。

柴星星(1985-)，男，碩士，研究方向為神經系統疾病的病理和生理機制，E-mail: chaixingxingyu@163.com

鮑波(1968-)，男，副教授，碩士生導師，研究方向為神經系統疾病的病理和生理機制。主持廣東省自然科學基金項目2項，湛江市科技攻關課題1 項及廣東醫學院院級課題2項，作為主要參與人參與2項國家自然科學基金、3項省部級科學基金研究。E-mail:you_and_me_2008@yeah.net

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.003

R742.5

A

1002-266X(2015)01-0009-04

2014-09-18)