局灶性腦缺血大鼠腦組織硫化氫水平的動(dòng)態(tài)變化

駱海坤　張建新　李國(guó)風(fēng)

作者單位: 054000河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院藥劑科(駱海坤);河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所(張建新、李國(guó)風(fēng))

局灶性腦缺血大鼠腦組織硫化氫水平的動(dòng)態(tài)變化

駱海坤張建新李國(guó)風(fēng)

作者單位: 054000河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院藥劑科(駱海坤);河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所(張建新、李國(guó)風(fēng))

【摘要】目的觀察大鼠局灶性腦缺血過程中不同時(shí)間內(nèi)源性H2S含量的變化。方法健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共192只，體重250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血1 h組、缺血3 h組，缺血6 h組，缺血9 h組，缺血12 h組，缺血24 h組。假手術(shù)組共48只(不同時(shí)間點(diǎn)各8只)，其余組各8只。其中96只觀察計(jì)算梗死體積，另96只測(cè)定其他指標(biāo)。采用Zea-Longa線栓法建立局灶性腦缺血模型，參照Longa評(píng)分法，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)分，于術(shù)后1、3、6、9、12和24 h后斷頭取腦，觀察并計(jì)算腦梗死體積，檢測(cè)腦組織中H2S水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，缺血1 h組無明顯變化，從缺血3 h到24 h，出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，缺血3、6、9、12和24 h時(shí)梗死灶增大(P＜0.01)，各組大鼠腦組織中H2S水平均明顯降低(P＜0.05或＜0.01)。結(jié)論缺血3h后，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，腦組織梗死體積逐漸增大，H2S含量明顯降低。

【關(guān)鍵詞】硫化氫;梗死體積;局灶性腦缺血;氧化應(yīng)激

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缺血性腦損傷是因局部血管栓塞造成的腦循環(huán)血流量減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一。大量文獻(xiàn)證實(shí)，H2S參與了腦缺血性損傷的發(fā)生。內(nèi)源性H2S作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用［1，2］。有學(xué)者報(bào)道H2S可通過對(duì)抗線粒體氧化應(yīng)激作用［2］，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞避免氧化損傷［2］，因此我們建立大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察大鼠在局灶性腦缺血過程中不同時(shí)間內(nèi)源性H2S的動(dòng)態(tài)過程，以探討其在局灶性腦缺血損傷中的作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組健康雄性SD大鼠，192只，體重250～300 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): 1110096。隨機(jī)分為假手術(shù)組(n =48)和缺血組(n =48)根據(jù)時(shí)間分為1、3、6、9、12、24 h亞組，每組8例。其中96只觀察計(jì)算梗死體積，另96只測(cè)定其他指標(biāo)。

1.2局灶性腦缺血損傷模型的制備采用Zea-Longa等線栓法建立局灶性腦缺血模型，大鼠10%水合氯醛麻醉，消毒皮膚，取頸正中切口，分離組織，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(exter-nal carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，電凝頸外動(dòng)脈的分支及頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈的交通支，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，電灼斷，在結(jié)扎部位近心端剪一小口入栓塞線，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至大腦中動(dòng)脈的起始處，長(zhǎng)度約18.5 mm。假手術(shù)組只做頸部手術(shù)，游離血管，但不插入線栓。

1.3神經(jīng)功能缺損的變化術(shù)后依照Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)分，以判定模型是否成功。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀; 1分:輕微神經(jīng)功能缺損，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展; 2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損，身體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn); 3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺損，身體倒向?qū)?cè); 4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。

1.4缺血體積變化阻斷大腦中動(dòng)脈后，7組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉，斷頭處死大鼠，快速取出完整的腦組織，置于－20℃冰箱內(nèi)，約20 min，腦組織冷凍堅(jiān)硬后，以2 mm間距冠狀切成6片，棄去嗅球及小腦組織。將切片浸泡在盛有20 ml 2%TTC溶液的玻璃器皿內(nèi)，置入37℃恒溫箱內(nèi)避光、孵育染色10 min，腦組織切片梗死區(qū)呈白色，非梗死區(qū)呈紅色，形成界限分明的不同區(qū)域，將切片移入盛有10%甲醛溶液的避光器皿中固定24 h，對(duì)切片照相，圖像進(jìn)行分析，觀察并計(jì)算大鼠缺血體積的變化。為減少大鼠腦水腫個(gè)體差異及拍照對(duì)腦梗死體積測(cè)定的影響，對(duì)每只大鼠以梗死體積/全腦體積(IV%)作統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.5組織中H2S含量的測(cè)定采用去蛋白的方法測(cè)定［3］，用不同濃度的NaHS繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠開顱取腦，分離出缺血側(cè)腦組織，放入液氮保存?zhèn)溆谩Ｓ?～4℃的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH組7.4)制備勻漿(質(zhì)量體積比為12%)，勻漿液離心(47 000×g，10 min，4℃)，取75 μl上清液移至另一離心管中，在室溫下加入0.25 ml的1%醋酸鋅及0.45 ml蒸餾水孵育10 min，然后加入10%三氯乙酸0.25 ml再次離心(14 000×g，10 min，4℃)，收集清澈的上清液，加入133 μl的N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽(20 mmol/L)/HCl(7.2 mol/L)緩沖液及133 μl的FeCl3(30 mmol/L)/HCl(1.2 mol/L)緩沖液，充分混勻。20 min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-TEK EL×800，美國(guó))在波長(zhǎng)670 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)不同濃度NaHS繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中的H2S含量，以單位重量的腦組織中H2S的量(nmol/g)表示

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.17組神經(jīng)功能缺損的變化與相應(yīng)假手術(shù)組比較，各缺血組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，表現(xiàn)為提起尾巴對(duì)側(cè)前肢無力曲屈，身體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，身體倒向?qū)?cè)等。

2.27組缺血體積變化假手術(shù)組大鼠在1～24 h無明顯變化，與相應(yīng)假手術(shù)組大鼠比較，缺血1 h時(shí)大鼠腦組織無明顯缺血灶，缺血3 h時(shí)可見明顯梗死灶(P ＜0.01)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，缺血6、9、12 h和24 h時(shí)缺血體積明顯增大(P＜0.01)。見圖1，表1。

圖1　缺血后染色的腦切片變化

表1　7組不同時(shí)間缺血體積變化　%，±s

表1　7組不同時(shí)間缺血體積變化　%，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01

組別　缺血體積假手術(shù)組(n =48)0缺血1 h(n =8)　0缺血3 h(n =8)　29.2±5.8*缺血6 h(n =8)　32.1±4.0*缺血9 h(n =8)　34.8±2.9*缺血12 h(n =8)　35.8±3.7*缺血24 h(n =8)　38.2±2.5*

2.3腦組織中H2S含量的變化假手術(shù)組大鼠腦組織中H2S含量在缺血后1～24 h無明顯變化。與相應(yīng)假手術(shù)組大鼠比較，缺血1 h時(shí)大鼠組織中H2S含量無明顯變化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，缺血3、6、9、12和24 h大鼠腦組織H2S含量均明顯降低(P＜0.05或＜0.01)。見表2。

3　討論

建立大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)，是研究缺血性腦損傷的重要方法，Longa線栓法［4］具有不用開顱，損傷小，易操作且模擬性強(qiáng)等特點(diǎn)，應(yīng)用較廣泛。線栓由頸外動(dòng)脈進(jìn)入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈，至大腦中

表2　不同時(shí)間腦組織中H2S含量變化　n =8，±s

表2　不同時(shí)間腦組織中H2S含量變化　n =8，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

時(shí)間　組別　H2S (nmol/g)1 h　假手術(shù)組40±10缺血組　34±6 3 h　假手術(shù)組　37±8缺血組　24±6*6 h　假手術(shù)組　38±8缺血組　22±6#9 h　假手術(shù)組　37±8缺血組　26±7*12 h　假手術(shù)組　34±3缺血組　24±5#24 h　假手術(shù)組　38±8缺血組　25±6#

動(dòng)脈起始處，進(jìn)入長(zhǎng)度約18.5 mm，阻斷血液循環(huán)，引起大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的腦組織局灶缺血，從而形成局灶性腦缺血模型。本研究建立模型時(shí)，對(duì)Longa線栓法進(jìn)行了改良，在頸部正中切口，分離出血管后不用血管夾，改用縫合線牽引阻斷頸總動(dòng)脈血流，松開牽引即恢復(fù)血流，避免出現(xiàn)難以控制的出血，不需結(jié)扎頸總動(dòng)脈。采用Longa評(píng)分法表明，缺血模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為提起尾巴右側(cè)前肢無力屈曲，身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，倒向右側(cè)。同時(shí)，對(duì)缺血大鼠腦組織切片染色，清楚可見大鼠大腦左側(cè)額頂皮質(zhì)以及基底節(jié)區(qū)明顯的梗死區(qū)，呈白色，而血液循環(huán)正常的血流供應(yīng)區(qū)呈現(xiàn)紅色，界限分明，易于分辨，表明栓塞效果良好，模型制備成功。

H2S廣泛存在于哺乳動(dòng)物的多種組織和器官中，有報(bào)道內(nèi)源性H2S在大鼠腦內(nèi)的濃度是50～160 μmol/L［5］，Eto等［6］通過基因敲除研究認(rèn)為，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成H2S的主要酶是CBS，最近Shibuya等［7，8］研究敲除CBS基因的小鼠證實(shí)，3MST是神經(jīng)系統(tǒng)生成H2S的重要酶，3MST與半胱氨酸丙轉(zhuǎn)氨酶(CAT)共同作用，以L-半胱氨酸和a-酮戊二酸為底物，生成H2S，并證實(shí)神經(jīng)系統(tǒng)中由3MST酶促產(chǎn)生的H2S含量較高。CAT與3MST酶體系的發(fā)現(xiàn)，可能為H2S的生成及作為信號(hào)分子提供新的見解，但是H2S和3MST的關(guān)系及作用機(jī)制還不是很清楚。在研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)發(fā)生發(fā)展時(shí)，任彩麗等［9］觀察到腦皮層H2S含量亦呈動(dòng)態(tài)變化，認(rèn)為H2S在缺血性腦血管病的病理生理變化中可能起著重要的作用，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞模型，觀察了大鼠體內(nèi)H2S含量在缺血不同時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化及腦組織梗死體積的改變，結(jié)果表明與假手術(shù)組比較，缺血1 h組大鼠腦組織無明顯梗死，H2S含量也無明顯變化，在缺血3 h后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，腦組織梗死體積逐漸增大，腦組織明顯受損傷，H2S含量明顯降低，提示H2S參與了局灶性腦缺血的發(fā)生發(fā)展過程。H2S可能通過抗氧化應(yīng)激作用，升高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，避免谷氨酸的氧化毒性作用的損傷，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用［10］。鄧芳帆等［11］的研究得出結(jié)論，H2S可下調(diào)腦組織caspase-3表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。通過研究硫化氫對(duì)全腦缺血-再灌注大鼠損傷的作用，任彩麗等［12］認(rèn)為H2S對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能跟抗脂質(zhì)過氧化損傷、清除自由基，提高抗氧化劑能力有關(guān)。楊燕等［13］以帕金森病(PD)細(xì)胞模型，探討硫化氫對(duì)該模型的保護(hù)作用及機(jī)制，結(jié)論提示，硫化氫可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)活性改善PD細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激狀態(tài)，以減少氧自由基生成，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少線粒體損傷，最終減少細(xì)胞死亡。

綜上所述，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)H2S可能通過抑制及清除氧化性物質(zhì)的作用，減輕氧化應(yīng)激，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。H2S在缺血性腦血管病的病理生理變化中可能起著重要的作用，有望成為新的臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)，其對(duì)腦組織的保護(hù)作用及具體機(jī)制我們將進(jìn)一步研究。

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Dynamic changes of content of hydrogensulfide in brain tissue of focal cerebral ischemia of rats

LUO Haikun，ZHANGJianxin，LI Guofeng.
Department of Pharmacy，The Third Hospital of Xingtai City，Hebei，Xingtai 054000，China

【Abstract】Objective To observe the changes of content of endogenous hydrogensulfide (H2S)during different time points in brain tissue of focal cerebral ischemia of rats.Methods One hundred and ninety-two male Sprague-Dawley (SD)rats weighted 250～300g were randomly divided into seven groups: sham-operation group，ischemia 1h，3h，6h，9h，12h，24h group，with 96 rats in sham-operation group and 16 rats in each ischemia group.Among 192 rats，the infarction area in 96 rats were detected，however，the other parameters were detected in the other 96 rats.The focal cerebral ischemia models in rats were established by Zea-Longa thread ligation，then according to Longa scoring method，the neurologic impairment degree scoring was performed.The cerebral infarction area was calculated by means of image analysis system at 1h，3h，6h，9h，12h，24h after operation and the levels of H2S in brain tissue were detected.Results As compared with those in sham-operation group，the symptoms of neurological impairment were more and more obvious from 3h to 24h after ligation，with the time going on，the cerebral infarction area was gradually increased from 3h to 24h (P＜0.01).Furthermore the levels of H2S in brain tissue were significantly decreased in ischemia 3h，6h，9h，12h and 24h groups，as compared with those in sham-operation group (P ＜0.05 or P＜0.01).ConclusionWith time going on，the cerebral infarction area in rats is gradually increased from 3h to 24h after ischemia and the contents of H2S were obviously decreased，which suggests that H2S may play an important role during physiopathologic process of focal cerebral ischemia.

【Key words】hydrogen sulfide; infraction volume; focal cerebral ischemia; oxidative stress

(收稿日期:2014－10－23)

通訊作者:張建新，050021石家莊市，河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.009

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0833－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 329.481.1