新疆傳統乳品中乳酸菌的抗氧化能力*

蔣琰潔，李寶坤，李開雄，盧士玲，王慶玲，蔣彩虹，樊哲新，朱敏

(石河子大學食品學院，新疆石河子，832000)

乳酸菌具有抗癌、降低膽固醇、增強免疫力、治療慢性尿道感染以及延緩衰老等功效［1］，這主要是由乳酸菌的抗氧化這一特性發揮作用。乳酸菌的抗氧化活性已經通過體外和體內實驗得到證實［3］，人們對于功能性食品和含有益生菌的乳制品的使用越來越感興趣，他們在胃腸道疾病的預防及治療方面都有涉及。因而，乳酸菌勢必成為人們首選的新型抗氧化劑。

本文從酸奶和干酪中初步分離得到24株乳酸菌菌株，通過過氧化氫耐受性實驗初步篩選獲得7株高耐受性的菌株。在此基礎上，對乳酸菌的無細胞提取物及細胞菌懸液的抗氧化性能進行比較研究，旨在為乳酸菌抗氧化劑的應用提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株的活化與培養基

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、魏斯氏菌(Weissella cibaria)和面包乳桿菌(Lactobacillus panis)為實驗室保藏菌株。

將7株已純化的乳酸菌菌株樣品分別接種于MRS培養基中，置于37℃培養箱中活化培養24 h，連續傳代2次，然后劃線接種于固體MRS培養基中培養48 h。

MRS培養基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖 20 g、MgSO40.58 g、檸檬酸氫二銨 2 g、K2HPO42 g、乙酸鈉5 g、MnSO40.25 g、吐溫1 mL，去離子水1 000 mL，pH6.2 ～6.6，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑

二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、三氯乙酸(TCA)、過氧化氫、O-菲羅啉、FeSO4、鐵氰化鉀、FeCl3、甲醇，為國產分析純試劑 北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

722可見光分光光度計，北京精密科學有限公司;Neofuge臺式高速冷凍離心機，力康發展有限公司;BS2000S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;MA110電子分析天平，上海第三天平儀器廠;DNP-9272生化培養箱，上海精密試驗設備有限公司;LDZX-40滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;HI8424NEW酸度計，北京哈納科儀科技有限公司;KQ-200VDE雙頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;DK-8D恒溫水浴鍋，金壇市醫療器械廠;超凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的培養及無細胞提取物的制備

菌株以MRS培養基在37℃培養24 h，傳3代后，培養液5 000×g離心15 min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液洗滌后重懸，調整菌數至109/mL。將所得懸液分為2組:活細胞組(IC)和無細胞提取物的制備組。將菌懸液冰浴超聲波破碎，4℃ 10 000×g離心20min，收集上清液，即為無細胞提取物(CFE)。

1.3.2 清除羥自由基實驗

在試管中依次加入O-菲羅琳(2.5 mmol/L)、磷酸緩沖液(0.02 mol/L，pH=7.4)、蒸餾水各1 mL，充分混勻后加入FeSO4(2.5mmol/L)1 mL，混勻再加入H2O2(0.01%)1 mL，37℃水浴1 h后在536 nm處測其吸光度為A1;用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2為A0;用1 mL樣品代替1 mL蒸餾水為As［4-6］。

1.3.3 清除DPPH自由基實驗

1 mL樣品加入1 mL DPPH甲醇溶液(0.2 mmol/L)，放置室溫下暗反應30 min后，在517 nm處測吸光度，以磷酸緩沖液作為空白對照［7-10］。

1.3.4 清除超氧陰離子實驗

將0.1 mL樣品加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，25℃水浴預熱20 min后，加入0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，于25℃水浴反應5 min，立即滴入2滴8 mol/L的HCl終止反應，在325 nm處測定吸光度，用蒸餾水調零。空白組用0.1 mL H2O代替樣品即為A0［11］。

1.3.5 還原能力測定

在0.5 mL待測樣品中加入0.5 mL磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH=6.6)及0.5 mL鐵氰化鉀(質量分數為1%)，混勻后于50℃水浴20 min，反應后急速冷卻。再加入0.5 mL三氯乙酸(質量分數為10%)，4 000×g離心10 min，取1 mL上清液，加入蒸餾水和FeCl3(質量分數為0.1%)各1 mL，混勻后靜置10 min。在700 nm處測定吸光度，吸光度越大代表樣品的還原能力越強［12］。

1.3.6 亞鐵離子螯合能力測定

在試管中依次加入0.1 mL抗壞血酸(質量分數1%)，0.1 mL FeSO4(質量分數0.4%)，1 mL 0.2mol/L NaOH混勻后，混合液中加入0.5 mL待測樣品，于37℃水浴20 min后，三氯乙酸沉淀蛋白3 000×g離心10 min，取0.2 mL上清液加入2 mL O-菲羅琳(質量分數0.1%)，10 min后在510 nm處測定吸光度，以磷酸緩沖液作為空白對照［13，14］。

2 結果與分析

2.1 清除羥自由基實驗結果

生命體在代謝的過程中會產生許多自由基，其中羥自由基活性最強，因而氧化能力也極強。所以，本文主要研究乳酸菌對羥自由基的清除能力以確定其抗氧化效果。

由圖1、圖2可知，7株乳酸菌都存在一定的羥自由基清除能力，面包乳桿菌的完整細胞液和無細胞提取物的羥自由基清除能力均為最強，和其余幾株乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。無細胞提取物的羥自由基清除能力與完整細胞液相比要弱很多。因而，乳酸菌清除羥自由基的活性物質主要存在于菌體表面和代謝產物中，而不是細胞內。另外，不同的乳酸菌具有不同的羥自由基清除能力，同種乳酸菌12-4、15和24-7之間的羥自由基清除能力差異并不顯著，這可能是不同乳酸菌所含活性物質不同所決定的。

2.2 清除DPPH自由基實驗結果

DPPH紫外分光測定法是一種常見的用來評價和篩選待測樣抗氧化效果的有效方法，常用來評價和檢測待測物的抗氧化能力［15］。在本實驗中加入了乳酸菌的完整細胞或無細胞提取物，通過對檢測乳酸菌對DPPH自由基清除能力的高低可以顯示出其抗氧化能力的強弱。

由圖3和圖4可知，7株乳酸菌的完整細胞液和無細胞提取物并不全具有一定的DPPH自由基清除能力，其中2-5的完整細胞液和無細胞提取物均不具有DPPH自由基清除能力，19-10的完整細胞液不具有DPPH自由基清除能力，其余菌株的清除力差異顯著。乳酸片球菌完整細胞液的DPPH自由基清除能力最強，與其余菌株相比差異顯著(P＜0.05);植物乳桿菌12-4無細胞提取物的DPPH自由基清除能力最強，與其余菌株相比差異顯著(P＜0.05)。其中乳酸片球菌完整細胞液的DPPH自由基清除能力要明顯高于其他菌株，無細胞提取物的DPPH自由基清除能力要明顯低于其他菌株，說明菌株清除DPPH自由基的活性物質存在于不同的細胞部位。綜合來看，魏斯氏菌的DPPH自由基清除能力相對較強。

2.3 清除超氧陰離子實驗結果

超氧陰離子自由基雖然不能直接與生物和食品體系中的脂類發生氧化反應，但它可以在金屬離子的催化作用下發生芬頓反應，產生活性較高的羥自由基。一般此種方法常用來測定乳酸菌清除超氧陰離子自由基的能力。LIU等［16］研究發現，人體在攝入某些乳酸菌后不僅可以降低活性氧的積累，還能降低超氧陰離子和過氧化氫的濃度。

由圖5和圖6可知，以上7株乳酸菌的完整細胞液和無細胞提取物均具有一定的超氧陰離子清除能力，完整細胞液組中的乳酸片球菌的超氧陰離子清除能力最強，與其余6株乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05);無細胞提取物組中的植物乳桿菌15的超氧陰離子清除能力最強，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。比較完整細胞組及無細胞提取物組，發現各菌株的完整細胞液對超氧陰離子的清除能力均高于無細胞提取物。實驗表明，乳酸菌清除超氧陰離子的活性物質大部分存在于細胞外。由實驗可以得出，在7株乳酸菌中乳酸片球菌和植物乳桿菌15的超氧陰離子清除能力較強。

2.4 還原能力測定結果

研究表明，一種物質的還原能力可以作為它是否具有抗氧化活性的重要指標［17-19］。還原能力，是指一些酶和非酶復合物具有減少氧自由基和螯合亞鐵離子的能力，從而減少氧化反應的發生。

由表2可知，7株乳酸菌均表現一定的還原能力，其中面包乳桿菌的還原能力最強，與其余6株乳酸菌相比還原能力差異顯著(P＜0.05);同種乳酸菌12-4、15和24-7之間的羥自由基清除能力差異并不顯著;無細胞提取物中并未檢測出任何還原能力。實驗表明，乳酸菌具有還原能力的活性物質均存在與細胞表面或代謝產物中，而并不存在于胞內提取物中。

2.5 亞鐵離子螯合能力測定結果

由圖7和圖8可知，以上7株乳酸菌除了魏斯氏菌的無細胞提取物外，其余6株菌的完整細胞液和無細胞提取物都具有亞鐵離子螯合能力，完整細胞液組中的植物乳桿菌15的亞鐵離子螯合能力最強，螯合率高達56.97%，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05);無細胞提取物組中的植物乳桿菌24-7的亞鐵離子螯合能力最強，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。比較完整細胞組及無細胞提取物組，發現各菌株的完整細胞液對亞鐵離子的螯合能力均高于無細胞提取物。實驗表明，乳酸菌亞鐵離子螯合的活性物質大部分存在于細胞外。在7株乳酸菌中，植物乳桿菌15和24-7的亞鐵離子螯合能力較強，這與Lee等［21］研究發現乳酸菌的抗氧化效果是通過螯合銅離子和亞鐵離子來實現是一致的。

3 結論

研究發現乳酸片球菌、魏斯氏菌、面包乳桿菌、植物乳桿菌和耐久腸球菌都具有一定的抗氧化活性，但彼此差異較大，即使是同一種乳酸菌如植物乳桿菌，也存在較大差異。其中，面包乳桿菌的羥自由基清除能力和還原能力最強，魏斯氏菌的DPPH清除能力相對較強，植物乳桿菌的超氧陰離子清除出能力和亞鐵離子螯合能力相對較高。。

通過研究還發現，不同乳酸菌的抗氧化能力不同且差異較大，可能是因為具有抗氧化能力的活性物質種類或濃度不同;另外，同一種乳酸菌的完整細胞液和無細胞提取物的抗氧化能力也不同，這可能是具有抗氧化能力的活性物質存在于不同的細胞部位導致。通過與其他相關實驗的研究結果比較，本實驗中的植物乳桿菌具有更高的抗氧化活性［6-8］。

［1］ 趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應用研究［M］.北京:科學出版社，1999:11-18.

［2］ 張江巍，曹郁生.乳酸菌抗氧化活性的研究進展［J］.中國乳品工業，2005，33(1):34-37.

［3］ 王寧，薛源，孫體健.莧菜紅色素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用［J］.山西醫科大學學報，2009，40(5):458-460.

［4］ LUO Y C，CHEN G，LI B，et al.Evaluation of antioxidative and hypolipidemic properties of a novel functional diet formulation of Auticularia auricala and Hawthorn［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10(2):215-221.

［5］ 張江巍，曹郁生，李海星，等.乳酸菌抗氧化活性及檢測方法［J］.中國乳品工業，2005，33(9):53-56.

［6］ 張鳳敏，田豐偉，陳衛，等.具有抗氧化活性乳酸菌的篩選［J］.中國乳品工業，2007，35(2):4-7.

［7］ 吳平格，楊懷霞，陳志紅，等.DPPH·法評價葡糖籽梯度滲漉各組分的抗氧化性能［J］.食品科技，2005(10):40-42.

［8］ 范金波，蔡茜彤，馮敘橋，等.5種天然多酚類化合物抗氧化活性的比較［J］.食品與發酵工業，20140(7):77-83.

［9］ 張曉璐，徐凱宏.山楂葉總黃酮清除DPPH·和超氧陰離子自由基的活性研究［J］.林業科技，2008，33(5):51-54.

［10］ 李安林，茹宗玲，張換平.火棘果紅色素的超聲提取與抗自由基性能研究［J］.食品研究與開發，2008，29(9):11-14.

［11］ WU H C，CHEN H M，SHIAU C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Scomber austriasicus)［J］.Food Research International，2003，36(9-10):949-957.

［12］ WU S C，PAN C L.Preparation of algal-oligosaccharide mixtures by bacterial agarases and their antioxidative properties［J］.Fisheries Science，2004，70(6):1 164-1 173.

［13］ WU S C，WEN T N，PAN C L.The antioxidative properties of algal-oligosaccharide-lysates hydrolyzed by two bacterial agrases［J］.Fisheries Science，2005，71:1 149-1 159.

［14］ 許士凱.實用抗衰老藥物手冊［M］.上海:上海中醫藥大學出版社，2004.

［15］ LIU C F，PAN T M.In vitro effects of lactic acid bacteria on cancer cell viability and antioxidant activity［J］.Journal of Food and Drug Analysis，2010，18(2):77-86.

［16］ Benkeblia N.Free-radical scavenging capacity and antioxidant properties of some selected onions(Allium cepa L.)and garlic(Allium sativum L.)extracts［J］.Brazillian Archives of Biology and Technology，2005，48(5):753-759.

［17］ Halliwell G J，Chen H J，Chang Y S，et al.Recombinant sporamin and its synthesized peptides with antioxidant activities in vitro［J］.Botanical Studies，2007，48:133-140.

［18］ MAO L C，PAN X，QUE F，et al.Antioxidant properties of water and ethanol extracts from hot air-dried and freezedried daylily flowers［J］.European Food Research and Technology，2006，222(3-4):236-241.

［19］ AL-Omar M A，Beedham C，Alsarra I A.Pathological roles of reactive oxygen species and their defence mechanisms［J］.Journal of Saudi Pharmaceutical，2004，12(1):1-18.

［20］ Lee J H，Wang K，Chung M Y，et al.Resistance of Lactobacillus casei KCTC 3260 to reactive oxygen species(ROS):role for a metalion chelating effect［J］.Journal of Food Science，2005，70(8):388-391.