不同時程低氧暴露對大鼠髓源性細胞HIF—1α與hGlyrichin表達影響的研究

沙繼斌+陳巖+萬利+葛新發

山東體育學院學報第30卷第6期2014年12月 沙繼斌，等不同時程低氧暴露對大鼠髓源性細胞HIF-1α與hGlyrichin表達影響的研究No.6 2014已有研究證明低氧應答的核心元件HIF-1α與機體固有免疫機能存在密切聯系，HIF-1α表達上調可激活血液中的髓源性細胞使固有免疫應答增強[1]，并可上調抗菌肽的表達；HIF-1α的增效劑含羞草堿[2]及近期報道的HIF-1α穩定劑AKB-4924[3]自身并無抗菌活性，但可以通過提高胞內HIF-1α表達以增強巨噬細胞與上皮細胞的抗菌活性，有效抑殺具有甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌。hGlyrichin是近年來發現的富含甘氨酸的新型抗菌肽家系的重要人源性成員，其結構及抗菌活性已得到初步確證[4-5]。本研究嘗試同步觀察不同時程低氧暴露對HIF-1α表達及hGlyrichin表達的影響，為分析二者之間的可能聯系提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性Wistar大鼠60只，體重207±11.4 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心（動物許可證號：SCXK（軍）2007-004），隨機分為對照組、低氧12、24、36、48、72小時組，分籠常規飼養，自由飲水、進食。采用hypoxico系統模擬海拔2500米常壓低氧環境以進行間歇性低氧暴露，每日2小時。累計低氧暴露時間分別為12、24、36、48、72小時后，尾靜脈收集靜脈血，肝素抗凝，以淋巴細胞分離液分離去除淋巴細胞和單核細胞，然后用右旋糖酐（dextran） 沉降與低滲法去除紅細胞，從而得到純度較高的多形核白細胞，-80℃保存以備指標測定。

1.2主要試劑淋巴細胞分離液（購自Gibco），Trizol（購自Invitrogen），RT-PCR試劑盒（購自Promega），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS（購自Sigma），HIF-1α抗體（購自Abcam），IPG膠條及buffer（購自Bio-rad），常規試劑均為國產分析純

1.3引物序列hGlyrichin上游引物： 5-CGCATGCCGGTGGCCGTGGGT-3， 下游引物：5-CCGTTAGCATCGGATGCCCAT-3；HIF-1α上游引物：5-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3，下游引物：5-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3；G3PDH上游引物：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3；均由英駿公司合成。

1.4實驗方法

1.4.1RNA提取以1‰DEPC水處理所有提取RNA用品，用Trizol裂解液按照《分子克隆指南》RNA提取方法從多形核白細胞中提取RNA，所有離心操作均在4℃冷凍離心機中進行，收集RNA沉淀后在無菌操作臺中風干，而后將沉淀溶于20 μl 去離子水，瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA。

1.4.2RT-PCR

1.4.2.1逆轉錄取所提取RNA10μg與Oligod（T）1 μl混勻后，65℃水浴10 min后迅速置于冰上冷卻5 min，按照如下反應體系依次加入下列試劑：RNA酶抑制劑3 ul，AMV RT5×Reactiong Buffer1 ul，100mM DTT1ul，10mM dNTP 4ul，AMV反轉錄酶1ul，1‰ DEPC 水加至總體積為20 ul，混勻后置于42℃恒溫箱中反應1 h，取逆轉錄產物cDNA 2 μl作為PCR模板，同時以G3PDH作為內參。

1.4.2.2PCR逆轉錄所得cDNA2ul，hGlyrichin/HIF-1α上游引物0.5 ul，hGlyrichin/HIF-1α下游引物0.5 ul，G3PDH上游引物0.5 ul，G3PDH下游引物0.5 ul，2.5 μM dNTP4 ul，10×PCR緩沖液2 ul，rTaq酶0.5 ul，ddH2O加至總體積為20 ul；95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，56℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共32個循環，72 ℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR結果。

1.4.3Western BlotSDS-PAGE結束后取下凝膠，在電轉儀中與預處理過PVDF膜按次序疊放好，采用半干法轉膜，電壓12 V，轉膜30 min；將電轉后的膜在2.5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；TBS沖洗3次，5 min/次；用TBS按1：3000稀釋兔源HIF-1α一抗，與PVDF膜作用2 h；TBST沖洗3遍，每次15 min；用TBS按1：5000稀釋HRP標記羊抗兔二抗，與PVDF膜作用2 h；TBST沖洗3遍，每次15 min；將A液、B液等體積混合，將混合物覆蓋在膜表面1～2 min，在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面放入暗盒中，曝光1 min后顯影、定影，定影后用去離子水沖洗，以β-actin作為內參蛋白，觀察結果。

1.4.4雙向電泳取對照組與低氧72小時組收集所得髓源性細胞制備蛋白樣品后參照Gorg教授實驗室方法進行雙向電泳，膠條室溫下平衡10分鐘后，被動式泡脹，而后進行第一向等電聚焦（IEF）IEF結束后將膠條平衡兩次，采用12.5%的SDS膠進行第二向，電泳結束后取下凝膠用雙蒸水漂洗三次，參照EMBL的考馬斯亮藍染色方法進行染色加以優化，染色中止后用ImageScanner II 掃描儀掃描，然后用Image Master 2D Planium進行分析。將其中差異較大的四個樣品送質譜檢測，常規檢索條件設置：其中Mass values選擇 Monoisotopic ，Peptide Mass Tolerance設定為 ± 0.3 Da，Peptide Charge State設定為 1+ ，Max Missed Cleavages設定為1 ，Number of queries值設定為25。

2實驗結果

2.1不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞HIF-1α及hGlyrichin RT-PCR結果

2.1.1間歇性低氧后多形核白細胞RNA提取

如圖1所示，從大鼠多形核白細胞中所提取到的RNA 18s與28s兩條帶清晰、完整，紫外分光光度計檢測OD260/ OD280比值在1.8-2.0之間，表明所提取的RNA質量較好，適合用于下一步的RT-PCR。

圖1間歇性低氧暴露后多形核白細胞RNA電泳結果

1、2、3、4、5：間歇性低氧暴露12 h、24 h、36 h、48 h、72 h組多形核白細胞RNA；M：DL20002.1.2不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞HIF-1α及hGlyrichin的mRNA表達變化

如圖2所示，間歇性低氧暴露12 h后未見有HIF-1α條帶，在間歇性低氧暴露24 h后其表達量依然很低，未見明顯條帶，間歇性低氧暴露36 h后開始出現較明顯條帶，繼而在間歇性低氧暴露48 h組、間歇性低氧暴露72 h組中HIF-1α表達量持續顯著增加；與之相比，在不同時程間歇性低氧暴露后，hGlyrichin表達量未見有顯著改變。以上結果提示HIF-1α作為機體低氧應答的核心元件，對低氧刺激較為敏感，但較短時間低氧暴露并未使HIF-1α表達顯著上升，在低氧處理36 h后其表達量明顯升高且隨時程延長而持續增加。hGlyrichin作為一種在不同組織中廣泛分布的抗菌肽，可能由于本地表達水平較高，間歇性低氧暴露后其表達量并未受到低氧刺激的顯著影響。

圖2對照組與不同時程間歇性低氧暴露組

RT-PCR電泳結果

1.對照組； 2. 間歇性低氧暴露12 h組； 3. 間歇性低氧暴露24 h組；4. 間歇性低氧暴露36 h組；5. 間歇性低氧暴露48 h組；6. 間歇性低氧暴露72 h組，下同。2.2不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞HIF-1α蛋白表達變化

如圖3所示，與內參β-actin相比，HIF-1α蛋白表達量隨間歇性低氧暴露時程的而持續增加，其變化趨勢與RT-PCR結果基本一致。稍有不同的是，與RT-PCR結果相比，在間歇性低氧暴露24 h后蛋白印漬檢測已可見到較為顯著條帶。由于內參β-actin條帶灰度差異較大，故未進行定量分析比較。

圖3對照組與不同時程間歇性低氧暴露組

Western Blot結果2.3不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞蛋白質差異表達結果

蛋白樣品定量：以1 mg/ml的BSA溶液作為標準。分別取0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 μl標準BSA溶液于1.5 ml離心管中，加雙蒸水稀釋至100 μl，再加入1 ml工作液，混合均勻，60 min之內測出每管混合液在595 nm處的吸光度。以蛋白濃度為橫坐標，A595nm為縱坐標做工作曲線，如圖2～圖4。樣品的測定方法同上。分別取1、2、3、5、7.5、10 μl待測蛋白于1.5 ml離心管中，加入雙蒸水稀釋至100 μl，將蛋白樣品稀釋至合適濃度，按上述操作程序測定595 nm處的吸光度，按工作曲線測定樣品濃度，而后上樣。

雙向電泳膠圖顯示與對照組相比， 間歇性低氧暴露72 h后蛋白表達總體似呈下降趨勢（圖4a），經軟件比對后選取其中四個表達量差異較為顯著的點（圖4b）進行質譜鑒定，其中A、B、C三點表達量顯著增加，D點表達量顯著下降，質譜鑒定結果B點蛋白質為tropomyosin 4 ，低氧后其表達量顯著增高，其余未檢索出結果。

圖4對照組與間歇性低氧暴露

72 h組蛋白質差異表達結果

a .雙向電泳結果比較；b.有顯著表達差異蛋白點比較

3分析討論

對低氧生理應答的認識相繼經歷了由經典低氧效應到促紅細胞生成素（EPO），由EPO 到低氧誘導因子1（HIF-1），由HIF-1到氧感受器如脯氨酰羥化酶、天冬酰胺酰羥化酶的過程[1，6]，其中HIF-1在細胞低氧應答反應體系中居于核心地位。一般認為，低氧條件下，機體氧感受器感受到低氧信號刺激后，通過低氧信號轉導通路引起一系列應激性變化從而產生低氧適應，HIF-1在介導低氧應答過程中起著重要作用。

3.1不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞HIF-1α表達變化

HIF-1是由α和β兩個亞基組成異二聚體蛋白，HIF-1β為HIF-1的組成性表達亞基，而HIF-1α則為HIF-l的氧調節亞基。HIF-1α通常在穩定后移位入核，與配體芳香烴受體核轉位因子結合，而后通過與低氧應答元件的5端增強子序列結合而后激活其它特定的基因，可有效調節細胞、組織、器官不同水平的缺氧應答反應以維持氧穩態。[1]

已有研究證實HIF-1α在大鼠的一些器官中（腦、心、腎、肝、肺、骨骼肌）普遍表達，且在腦、肺、骨骼肌、腎可被低氧顯著誘導。低氧習服是機體在外界脅迫條件下，為了維持自身的穩定，減輕低氧對機體的損傷而采取的自身防御措施。低氧訓練應激對機體的刺激受不同氧濃度（模擬海拔高度）、低氧刺激時間、刺激方式條件影響，結果可能存在差異，但大多數研究結果支持在低氧應激后HIF-1α表達上調。[6]

王雪冰等研究發現[7]，相當于海拔3 500 m低氧訓練4周后大鼠腎皮質HIF-1α、VEGF mRNA水平均呈顯著上調，且HIF-1α與VEGF表達呈高度正相關。趙鵬等的研究結果也證實低氧和訓練能增加人體和動物骨骼肌 VEGF mRNA 水平[8]。汪曉筠等的研究發現與對照組比較，高原組大鼠血清中HIF-1α含量明顯增高，血漿中ROS含量明顯降低[9]。以上研究結果與我們的結果很相近，我們發現在間歇性低氧暴露時程累加到36小時后，HIF-1α mRNA水平開始出現顯著升高，之后隨時程延長其水平依然升高且具有顯著性。HIF-1α表達上調除可影響VEGF外，對其他下游因子同樣有較強調節效應，如黃麗英等的研究結果表明低氧運動后血清EPO水平顯著上升，腎臟EPO mRNA水平顯著升高[10]，低氧后HIF-1α表達增加是促進EPO產生分泌的主要因子。

低氧應激除可調節HIF-1α轉錄之外，還可以有效調節HIF-1α蛋白表達。瞿樹林課題組利用免疫組織化學染色觀察到模擬高海拔低氧環境及力竭性運動均可促進心、肝、腎HIF-1a 蛋白表達[11]，在低氧應激后心、肝、腎均可見到多量HIF-1α免疫陽性物質，主要集中于胞漿中，少量可見在胞核中表達。劉銘等將大鼠置于模擬海拔4000m高度的低氧倉中，持續低氧刺激4周后用免疫組化法檢測大鼠骨骼肌組織HIF-1α蛋白表達，結果發現HIF-1α在低氧應激后表達上調[12]，其表達水平隨著低氧刺激的時間延長而增高。我們采用蛋白印漬檢測了不同時程間歇性低氧暴露后HIF-1α的蛋白表達變化，結果發現在間歇性低氧暴露時間累加至24小時后有較明顯表達增加，之后表達水平隨間歇性低氧暴露時程延長呈上升趨勢，由于對照β-actin檢測表達水平不夠穩定，未進行定量分析。該結果與上述研究者結果相類似，但與所檢測到的HIF-1α mRNA水平在間歇性低氧暴露累計到36小時后才開始有顯著升高的變化趨勢并不一致。用雙向電泳結合質譜分析蛋白質差異表達時只鑒定出tropomyosin 4一種蛋白質，作為原肌球蛋白家族的一員，目前尚未有其與低氧密切相關的研究報道。

3.2不同時程間歇性低氧暴露后多形核白細胞抗菌肽hGlyrichin表達變化

固有免疫是機體抵御外來的細菌、病毒及其他有害病原體的古老應激反應，是維系組織穩態及正常生命的必備先決條件，已有研究證實低氧與機體免疫力密切相關。人體中不同部位與區域氧分壓差別極大，肺泡毛細血管氧分壓約為100 mmHg，而淋巴器官氧分壓則可能降至約4 mmHg，上述不同部位及區域微環境的巨大差異使得固有免疫相關髓源性細胞產生相應的代謝性適應，氧分壓改變成為調節髓源性細胞機能的重要信號。

固有免疫系統的髓源性細胞在正常情況下都處于靜息狀態，而活性氧誘發的細胞結構完整性損傷可導致髓源性細胞的激活，進而引發炎癥反應，炎癥反應可能是低氧與固有免疫的交叉點之一。固有免疫系統中的多型核白細胞可通過氧依賴性以及非氧依賴性的兩方面抗菌系統來發現、識別、吞噬、最終消滅入侵的病原微生物， PMN細胞數目的減少意味著機體免疫機能抑制或者說被感染的危險性增加。

HIF-1α在與病原微生物接觸后隨即被激活而后調節吞噬細胞的固有免疫機能[13-14]，抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是固有免疫系統的重要成分之一，具有直接抑殺病原微生物與針對宿主進行免疫調節的雙重作用。在HIF-1被選擇性敲除的角質細胞當中，cathelicidin的分泌顯著減少，而壞死區域皮膚金黃色葡萄球菌的數量增加，反之，如果與HIF-1結合的腫瘤抑制蛋白VHL缺失的話，cathelicidin的分泌增加，金黃色葡萄球菌的感染率下降[15]，以上結果提示HIF-1對于抗菌肽的產生有直接調節作用[13-15]。我們的研究結果發現在間歇性低氧暴露后隨時程延長hGlyrichin表達水平有上升趨勢，但在不同時程時間點之間未觀察到顯著性差異。這可能與hGlyrichin本身是一種廣布于機體各組織的富含甘氨酸的天然抗菌肽，其在血液中本底表達水平較高有關。我們的實驗結果未能驗證不同時程間歇性低氧暴露后機體HIF-1α表達水平上調可促進hGlyrichin的表達的假設。

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