植物ICE1-CBF冷反應通路的激活與調控研究進展

魏俊燕趙佳趙仕琪周棋贏袁正仿李先文

（1.信陽師范學院生命科學學院，信陽 464000；2. 信陽師范學院華銳學院，信陽 464000）

植物ICE1-CBF冷反應通路的激活與調控研究進展

魏俊燕1趙佳2趙仕琪1周棋贏1袁正仿1李先文1

（1.信陽師范學院生命科學學院，信陽 464000；2. 信陽師范學院華銳學院，信陽 464000）

植物細胞可能是通過細胞膜流動性的改變引起胞質Ca2+濃度變化來感受低溫信號的。胞質Ca2+濃度升高引起胞內多種鈣調節蛋白的活性變化，再經過級聯反應激活冷反應基因，增強植物的抗低溫能力。目前，已基本清楚，冷反應基因激活的一條主要途徑是ICE1-CBF調節通路。概括介紹了近年來植物低溫信號感受、轉導、冷反應基因的表達激活和調節方面的研究概況，旨在為植物冷馴化的進一步研究奠定理論基礎。

植物；冷反應基因；信號轉導；表達調節

據估計，每年世界主要農作物產量損失的一半以上是由非生物脅迫造成，低溫冷害是其中一個主要的脅迫類型。因為地球陸地面積中，大約有42%的區域要經歷階段性或長期的-20℃以下的低溫。所以，研究植物對低溫的反應機制有重要的理論意義和應用價值。經過多年的探索，人們對植物的低溫反應機理已有了一些認識，本文是對植物冷反應基因（cold-responsive genes，CORs）的激活與調節等方面的研究進展作一綜述，旨在為植物冷馴化的進一步研究奠定理論基礎。

1 植物的冷馴化與冷反應基因

低溫寒凍是從亞熱帶到寒帶等廣大地區植物生長和發育的重要限制因素，是影響農林業生產的嚴重自然災害。但這些地區的多種植物經過長期的進化，已對低溫環境產生了一定的適應能力，進化出一套適應低溫的冷馴化機制，即它們在經受一段時間的非傷害低溫作用后，可使其耐低溫能力大大提升［1，2］。如黑麥在未經低溫馴化處理時，-5℃條件下就會被凍死，而經過一段時間的低溫馴化后，植株體可在-30℃條件下生存；北美杜鵑在冷馴化前后的耐凍能力分別為-7℃和-53℃［3］。

植物冷馴化的關鍵在于激活了大量的CORs，合成了多種冷誘導蛋白，從而啟動了多重增強植物抗凍性的生理機制［1，3］。Lee等［4］用微陣列分析揭示，擬南芥的24 000個基因中可被低溫誘導表達的基因有655個，下調表達的有284個，CORs在其基因組中約占20%；對茶樹低溫誘導轉錄組的分析也發現，有1 770個CORs（其中1 162個表達上調，602個被下調）［5］。至于CORs編碼產物的功能，目前的研究已表明，它們參與細胞的結構和代謝的多個環節，有信號轉導相關蛋白［如磷脂酶C（PLC）和鈣調素（CaM）等］、轉錄因子［如CBF（C-repeat binding factor）和ICE（inducer of CBF expression）等］以及多種與初級和次級代謝有關的酶（如甘油二酯激酶、過氧化物酶和脫水素等）。

2 植物冷反應基因的激活

植物CORs的激活涉及其冷馴化期間一系列復雜的信號感受、信息傳遞、基因表達和代謝模式改變等生理生化及分子生物學水平的復雜變化過程。對植物細胞低溫感受器的大量研究顯示，其低溫感知可能源自原生質膜物理化學性質的改變，因低溫可降低膜的流動性、增加其僵硬程度。如實驗證明，一種膜硬化劑——二甲基亞砜（DMSO）在25℃下也能誘導CORs基因，而增加膜流動性的苯甲醇甚至可在0℃下阻止CORs基因的表達；對擬南芥中油酸脫氫酶基因受損的fad2突變體的研究表明，野生型擬南芥植株的甘油二酯（DAG）激酶被誘導表達的溫度是14℃，而fad2突變體（其膜脂的飽和度變高）和亞油酸去飽和酶基因高表達的轉基因擬南芥植株的甘油二酯激酶分別在18℃和12℃時表達［6］。

低溫信號被植物細胞感受后，其信號傳遞的第二信使很可能是胞質Ca2+水平的變化。冷誘導的胞質Ca2+濃度增加可能是通過膜上機械張力敏感的或配體激活的Ca2+通道來實現的。例如，用一種機械張力敏感的鈣離子通道阻滯劑——鉬酸釓處理膜硬化的細胞，可阻斷或減弱胞質Ca2+信號和CORs基因的表達。利用膜片鉗技術對擬南芥葉肉細胞原生質體質膜冷誘導的膜電位變化的研究也顯示，冷活化的Ca2+通道才是胞質Ca2+信號的發源地［7，8］。而在紫花苜蓿（Alfalfa）和油菜（Brassica napus）研究中還發現，Ca2+通道開啟和細胞內Ca2+濃度增加還與冷誘導的質膜僵硬引起的細胞微絲骨架重排有關［8］。總之，植物抗凍性對胞質Ca2+濃度變化存在著依賴性。

Ca2+涌入細胞即激活了磷脂酶C和磷脂酶D（PLD），催化產生的肌醇-1，4，5-三磷酸（IP3）等可進一步活化存在于胞內鈣庫膜上的IP3門控Ca2+通道而放大Ca2+信號。細胞內Ca2+信號的接受者（或稱Ca2+感受器）有多個成員，如鈣依賴型蛋白激酶（CDPK）、CaM、鈣調磷酸酶B類蛋白（CBL）或類鹽高敏感蛋白-3（類SOS3）、蛋白磷酸酶2C（PP2C）等。冷脅迫產生的Ca2+信號就是通過它們而向下傳遞，從而引起COR基因的表達變化和植物耐冷性的增強［9，10］。CDPK（Ca2+dependent protein kinase）是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，依賴Ca2+但不依賴CaM，因為在這類蛋白激酶的C端有一段類似于CaM的結構域。在細胞內，CDPK幾乎遍布于所有細胞器中，并在非生物脅迫時被誘導或激活［11］。

3 植物冷反應基因表達的調節

現已基本查明擬南芥等植物的冷信號的進一步轉導至少可通過依賴CBF和不依賴CBF兩條途徑來完成。依賴CBF的冷信號轉導通路（又稱ABA非依賴信號轉導途徑）已被證實是賦予植物低溫抗性的主效途徑，因而使其成為低溫抗性領域研究的熱點之一。該信號途徑可較好的解釋草本植物的冷馴化過程。即植物在感知低溫后，啟動CBF基因表達，其編碼蛋白再激活下游啟動子中包含有C-重復（C-repeat，CRT）/DRE元件（dehydration responsive element）的冷反應基因（CORs）表達。CBF屬于乙烯反應元件結合因子/APETALA2（ERF/AP2）型轉錄因子家族。受CBF調控的CORs已發現至少有幾十種（如rd29、corl5A和cor47等），它們的編碼蛋白在低溫下合成后，引起組織細胞一系列生理生化變化，穩定細胞或蛋白的結構，恢復植物體內物質和能量代謝平衡，增強植物對低溫環境的適應性。因此，人們把CBF轉錄因子看作冷馴化的開關。而冷馴化時被激活的許多基因都屬于CBF調節的下游基因［1，4］。

擬南芥的CBF基因家族包括CBF1、CBF2和CBF3三個基因，聚集在擬南芥第4染色體短臂上［1，12］。實驗表明，擬南芥的3種CBF轉錄因子雖然都能啟動下游CORs的表達，但功能有一定差別，CBF1和CBF3的表達要先于CBF2基因，并對CBF2的表達起促進作用；而CBF2蛋白是CBFI和CBF3表達的負調節子。這樣也許可以保證幾個CBF基因表達是瞬時的、可控的，同時能確保其表達水平適合于誘導下游基因的表達，使擬南芥獲得抵抗寒冷和相關脅迫的能力。通常，當低溫誘導時，CBF1和CBF3基因優先表達，當積累到一定水平時，CBF2基因開始表達，產生的CBF2蛋白抑制CBF1和CBF3基因的表達，使CBF蛋白保持在適合需要的水平［1，12］。

CBF基因也受低溫誘導，在植物遭受低溫時，CBF轉錄本在15 min內即開始積累，2 h后含有CRT/DRE元件的一組CORs基因開始表達。但是，CBF基因的啟動子中不含CRT/DRE元件，且表達先于帶有DRE/CRT順式元件的CORs基因，因此，Gilmour等［13］提出，在正常生長溫度下，細胞內已存在有識別CBF啟動子的轉錄激活因子，并將這種未知的激活因子命名為“ICE”（inducer of CBF expression）蛋白。Chinnusamy于2003年分離得到了一個ICE1轉錄因子，它能識別CBF3啟動子區域的ICE盒子［14］。同年Daniel等［15］通過CBF2啟動子突變分析，鑒定出了兩個ICE盒：ICEr1（CACATG）和ICEr2（ACTCCG），而且，在ICEr1中存在一個保守的bHLH堿性螺旋-環-螺旋（basic helixloop-helix）轉錄因子結合位點（CANNTG）。ICEr1或ICEr2單獨存在時，對低溫的響應很弱，但當它們同時存在時對低溫的響應能力大大增強。現已查明，ICE1屬于組成型表達基因，編碼含bHLH的MYC類（MYC-like transcription factors）轉錄激活因子。在正常環境溫度時ICE1蛋白處于無活性狀態，低溫下被活化，特異性結合到CBF啟動子的順式作用元件（CANNTG）上，以主效開關的作用控制著CBF信號轉導途徑各組分的表達水平。大約40%的CORs和46%的冷調節轉錄因子基因被ICE1調節，說明盡管植物的冷馴化機制相當復雜，ICE1是CORs表達的主要調節者［12，16］。對ICE1和CBF轉基因植物抗寒性的研究，人們發現將CamV35S控制下的ICE1基因轉入擬南芥中，所得到的轉基因植株抗凍性與野生型植株相比有很大的提高；超表達LeCBF1和AtCBF3的轉基因番茄和擬南芥植株抗寒性也都明顯增強，但組成型表達CBF的轉基因植株（包括擬南芥、油菜、番茄、土豆和水稻等不同物種）都導致在正常條件下嚴重生長遲滯和開花延遲［1，7］。這些研究結果改變了過去人們將植物耐寒性當作數量性狀，認為由微效多基因共同控制，單獨改變其中幾個基因對植株的耐寒性影響不大的觀點。

CBF基因啟動子內除有MYC（如ICE）轉錄因子的識別區域外，還存在MYB類轉錄因子的識別區域［13］，研究表明MYB和MYC兩類轉錄因子協同調控CBF的表達，MYC主要表現為激活作用，而MYB主要表現為抑制作用。MYB15結合到CBF啟動子上抑制CBF及其調節元基因的表達。而ICE1負調節MYB15表達。Su等［17］在水稻發現了一條新的冷適應信號轉導途徑，他們通過功能缺失和獲得實驗分析發現，一個結合DNA單一重復的、介導水稻糖信號轉導的MYB轉錄因子——MYBS3，在水稻耐冷適應也起著關鍵作用，它對于提高水稻耐冷性是充分和必要的。組成型表達MYBS3的轉基因水稻至少可耐受一周的4℃低溫，與正常條件下的植株相比不產生明顯的差異。并通過過表達或抑制MYBS3表達的轉基因水稻的轉錄分析，鑒定出了多個MYBS3介導的冷信號途徑的基因，其中包括一些以前已被證明的可被MYBS3和冷所誘導激活的基因。而且發現，在水稻中MYBS3在轉錄水平上抑制著名的CBF依賴的冷信號轉導途徑。CBF反應迅速而短暫，但MYBS3對冷脅迫反應慢，由此暗示水稻為適應短期和長期的冷脅迫可采用不同的補償途徑。

另外，調節CBF表達的蛋白還有HOS1（High expression of osmotically responsive gene）、LOS4（Low expression of osmotically responsive genes 4）和MYB15等。HOS1是一種環指型泛素E3連接酶（RING E3 ligase）。適宜溫度下，HOS1進入細胞核，使ICE1和CBF多聚泛素化而被蛋白酶體降解。在HOS1組成型表達的轉基因植物中ICE1含量低，CBF及下游基因的表達受到抑制，植物的抗寒性大大降低［18］，所以HOS1是ICE和CBF的負調節子。SUMO（一種分子量約為11 kD的泛素類似蛋白）化翻譯后修飾也控制著ICE1依賴的冷信號轉導，ICE1和CBF的SUMO化阻斷了它們的多聚泛素化，表明泛素化和SUMO化修飾在功能上是競爭的。LOS4編碼一個DEAD-box RNA解旋酶（dead-box RNA heliease），可調節CBF基因的表達。FIERY2（FRY2）編碼一個轉錄抑制因子，此蛋白包含有兩個雙鏈RNA的結合域和1個與RNA酶ⅡC 末端起催化作用的結構同源的區域，RNA酶Ⅱ的這個區域在酵母和動物中可以調節基因的表達，說明FRY2可能調節抗逆基因的轉錄；CAX1（calcium exchanger 1）編碼液泡中的一個Ca2+/H+反轉運子，而此轉運子可以調節細胞內部的Ca2+水平。正常條件下，CAX1突變體植株的抗旱、耐鹽和抗寒能力與對照植株無明顯區別，但在冷馴化的條件下，CBF及其下游靶基因的表達都有所提高，說明CAX1通過控制CBF及其下游基因的表達，來保證擬南芥冷馴化的精確性［12，18，19］。最近，Shan等［20］在研究丙烯誘導香蕉果實的耐冷性與MaNAC1（香蕉的一種NAC類轉錄因子）基因的關系時發現，可被冷脅迫顯著誘導、在冷藏期間也被丙烯處理而顯著誘導的MaNAC1基因是MaICE1的一個新的直接靶點，MaNAC1是ICE1冷信號通路的一個下游組件。而MaICE1 與MaNAC1啟動子的結合能力可被MaICE1磷酸化和冷脅迫增強。這一研究結果豐富了人們對ICE1冷信號傳導在CBF之外的一個新的直接靶點、新的反應支路的認識。

植物對低溫等非生物逆境脅迫反應的調控還涉及脫落酸（abscisic acid，ABA）介導的信號途徑。該途徑是通過上游轉錄因子與ABA合成基因啟動子中的DRE（dehydration-responsive element）順式元件結合，激活ABA合成相關基因的表達，引起植株體內ABA含量上升，從而增強對低溫等逆境脅迫的耐受能力。但有時候這兩條途徑也存在交叉與互作［19］。

冷誘導基因的轉錄后調節還涉及前體mRNA加工和從細胞核輸出的轉錄后調控環節，最近在擬南芥和水稻的研究中已證明，小分子非編碼RNA（miRNA和siRNA）是造成轉錄后基因沉默的關鍵因子，在其冷響應基因表達的轉錄后調節中發揮著重要作用［19，21-23］。

Lee等［23］的研究還表明，在冷處理6 h以內，被上調的早期冷反應基因主要與轉錄和細胞信號轉導相關。在冷脅迫早期有多個轉錄因子被誘導，而表達被抑制的轉錄因子基因很少，說明植物對冷的反應最初主要是通過基因的轉錄激活，而不是轉錄抑制。而晚期（24 h冷處理）冷反應基因多與基因轉錄及代謝活動相關，此時所誘導的一些冷調節的受體樣蛋白激酶可能涉及到由早期冷反應所產生的次級信號的感受。另外，美國亞利桑拉大學的Lee等［24］在研究植物的低溫信號轉導時發現，線粒體復合物I的缺損降低了核基因在低溫條件下的表達，由此提出了“核基因的冷誘導表達還受線粒體功能的調節”的觀點。

盡管擬南芥等草本植物冷馴化的分子機理已得到較深入地研究，但木本植物的冷馴化與草本植物有所不同，其冷馴化能力更大，冷馴化機制也更復雜。Wisniewskia等［25］發現，篩選到的蘋果的冷反應基因中，盡管有70%左右與數據庫中的CORs高度相似，但還有超過20%的基因是全新的。目前，已有多種木本植物（如茶樹、藍莓、北美杜鵑、蘋果、楊樹和海濱松等）的低溫反應表達序列標簽（EST）被通過不同途徑篩選了出來，其中也有不少基因已得到了進一步研究［25-27］，可以預期在不久的將來，該領域必定會出現一些振奮人心的研究成果。

［1］ Novil1o F， Alonso JM， Ecker JR， et al. CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expresion and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis［J］. Proc Nat Acad Sci USA， 2004， 101（11）：3985-3990.

［2］ Maruyama K， Sakuma Y， Kasuga M， et al. Identification of coldinducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems［J］. Plant J，2004， 38（6）：982-993.

［3］ Wei H， Dhanaraj AL， Rowland LJ， et al. Comparative analysis of expressed sequence tags from cold-acclimated and non-acclimated leaves of Rhododendron catawbiense Michx［J］. Planta， 2005，221：406-416.

［4］Lee SC， Huh KW， An K， et al. Ectopic expression of a cold-inducibletranscription factor， CBF1/DREB1B， in transgenic rice（Oryza sativa L. ）［J］. Mol Cells， 2004， 18（1）：107-114.

［5］Wang XC， Zhao QY， Ma CL， et al. Global transcriptome profiles of Camellia sinensis during cold acclimation［J］. BMC Genomics 2013， 14：415.

［6］ Chinnusamy V， Zhu JK， Sunkar R. Gene regulation during cold stress acclimation in plants［J］. Methods Mol Biol， 2010， 639：39-55.

［7］ Carpaneto A， Ivashikina N， Levchenko V， et al. Cold transiently activates calcium-permeable channels in Arabidopsis mesophyll cells［J］. Plant Physiol， 2007， 143（1）：487-494.

［8］Sangwan V， Foulds I， Singh J， et al. Cold-activation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membranes and cytoskeleton， and requires Ca2+influx［J］. Plant J， 2001， 27：1-12.

［9］T?r?k Z， Crul T， Maresca B， et al. Plasma membranes as heat stress sensors：from lipid-controlled molecular switches to therapeutic applications［J］. Biochim Biophys Acta， 2013， 12：454-459.

［10］Soares DA， Oliveira MB， Evangelista AF， et al. Phospholipase gene expression during Paracoccidioides brasiliensis morphological transition and infection［J］. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2013， 108（6）：808-811.

［11］Lissarre M， Ohta M， Sato A， et al. Cold-responsive gene regulation during cold acclimation in plants［J］. Plant Signal Behav， 2010，5（8）：948-952.

［12］Haake V， Cook D， Riechmann JL， et al. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis［J］. Plant Physiol， 2002， 130（2）：639-648.

［13］Gilmour SJ， Zarka DG， Stockinger EJ， et al. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression［J］. Plant J， 1998， 16（4）：433-442.

［14］Chinnusamy V， Ohta M， Kanrar S， et al. ICE1：a regulator of coldinduced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis［J］. Genes Devel， 2003， 17：1043-1054.

［15］Daniel GZ， Jonathan TV， Daniel C， et al. Cold induction of Arabidopsis CBF genes involves multiple ICE（Inducer of CBF Expression）promoter elements and a cold-regulatory circuit that is desensitized by low temperature［J］. Plant Physiology， 2003，133：910-918.

［16］Miura K， Jin JB， Lee J， et al. SIZ1-mediated sumoylation of ICE1 controls CBF3/DREB1A expression and freezing tolerance in Arabidopsis［J］. The Plant Cell， 2007， 19：1403-1414.

［17］Su CF， Wang YC， Hsieh TH， et al. A novel MYBS3-dependent pathway confers cold tolerance in rice［J］. Plant Physiol， 2010，153（1）：145-158.

［18］Luis OS， Jonathan PA， Jodi Y， et al. AtERF14， a member of the ERF family of transcription factors， plays a nonredundant role in plant defense［J］. Plant Physiology， 2007， 143：400-409.

［19］Zhu JH， Dong CH， Zhu JK. Interplay between cold-responsive gene regulation， metabolism and RNA processing during plant cold acclimation［J］. Current Opinion in Plant Biology， 2007， 10：290-295.

［20］ Shan W， Kuang JF， Lu WJ， Chen JY. Banana fruit NAC transcription factor MaNAC1 is a direct target of MaICE1 and involved in cold stress through interacting with MaCBF1［J］. Plant Cell Environ， 2014， 37（9）：2116-2127.

［21］ Knight H， Zarka DG， Okamoto H， et al. Abseisic acid induces CBF gene transcription and subsequent induction of cold-regulated genes via the CRT promoter element［J］. Plant Physiol， 2004，135（7）：1710-1717.

［22］ Agarrwal M. A R2R3-Type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freeding tolerance［J］. J Biol Chem， 2006， 281（49）：37636-37645.

［23］Lee SC， Lee MY， Kim SJ， et al. Characterization of an abiotic stressinducible dehydrin gene， OsDhn1， in rice（Oryza sativa L.）［J］. Mol Cells， 2005， 19（2）：212-218.

［24］Lee BH， Lee H， Xiong L， et al. A mitochondrial complex I defect impairs cold-regulated nuclear gene expression［J］. Plant Cell，2002， 14（6）：1235-1251.

［25］Wisniewskia M， Bassett C， Norelli J， et al. Expressed sequence tag analysis of the response of apple（Malus×domestica ‘Royal Gala’）to low temperature and water deficit［J］. Physiologia Plantarum， 2008， 133：298-317.

［26］Li X W， Feng ZG， Yang HM， et al. A novel cold-regulated gene from Camellia sinensis， CsCOR1， enhances salt- and dehydrationtolerance in tobacco［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2010，394（2）：354-359.

［27］ Zhu Q， Zhang J， Gao X， et al. The Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2. 6 participates in ABA， salt and osmotic stress responses［J］. Gene， 2010， 457（1-2）：1-12.

（責任編輯 馬鑫）

Activation and Regulation on the Cold Response Pathway of ICE1-CBF in Plants

Wei Junyan1Zhao Jia2Zhao Shiqi1Zhou Qiying1Yuan Zhengfang1Li Xianwen1
（1. College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang 464000；2. Hua-Rui College，Xinyang Normal University，Xinyang 464000）

Cold stress signal is sensed while changes of cell membrane fluidity in plant cells cause the changes of Ca2+influx. The rising of Ca2+in cytoplasm leads to the changes of activities of various calcium-regulating proteins in plant cells， then cold-responsive genes are activated by cascade reactions， and thus plant resistance to low temperature is enhanced. At present， it is almost certain that the main path of activating cold-responsive genes is ICE1-CBF regulatory pathway. In this paper. We review the recent studies of the cold signal sensing and transduction，expression activation and regulation of cold-responsive genes in plant cells， which lays the theoretical foundation for the further study of cold acclimation of plants.

plants；cold-responsive genes；signal transduction；regulation of gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.016

2014-10-20

國家自然科學基金項目（31270727，U1404319），河南省重點科技攻關項目（082102150009）

魏俊燕，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學；E-mail：1039752416@qq.com

李先文，男，博士，教授，研究方向：植物脅迫生理學與分子生物學；E-mail：xianwenli01@sina.com