水產疫苗研究開發現狀與趨勢分析

王忠良王蓓魯義善吳灶和

（1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.仲愷農業工程學院，廣州 510225）

水產疫苗研究開發現狀與趨勢分析

王忠良1王蓓1魯義善1吳灶和2

（1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.仲愷農業工程學院，廣州 510225）

水產疫苗不僅能夠增強水產動物的免疫力，預防水產病害發生，還能減少各類藥物的使用，降低生殖生產成本，解決各種藥物殘留帶來的食品安全和環境污染等問題，使水產養殖業向綠色、可持續方向發展。因此，水產疫苗已成為水產動物病害防治領域的研究熱點。綜述了水產疫苗的發展歷程、水產疫苗種類與接種方式，并介紹了水產疫苗關鍵技術發展現狀與趨勢。

水產疫苗；種類；接種方式；現狀與趨勢

在人們對水產品質量安全和環境污染問題日益關注的今天，采用各種化學藥物防治水產養殖動物病害的方式越來越多地受到質疑。疫苗不僅能提高水產養殖動物機體的特異性免疫水平、有效預防疫病發生，且符合不污染環境、水產品無藥物殘留的要求，因此，疫苗已成為水生動物疾病防治領域研究與開發的主流產品，而接種疫苗也已成為國際現代水產養殖業的規范性生產標準。目前，針對鮭鱒魚類、歐洲鱸魚（Perca fluviatilis）、大西洋鱈魚（Gadus morhua）等國際上主要水產養殖品種均已開發出相應的商品化疫苗，并已成為國外以鮭鱒魚類為代表的重要經濟魚類養殖業成功的關鍵因素之一。在我國，水產疫苗的開發與應用步履蹣跚，與世界第一水產養殖大國的稱號極不相稱，更與水產養殖強國的發展目標相距甚遠。為此，本文綜述了水產疫苗的發展歷程、種類與接種方式，并介紹了水產疫苗關鍵技術發展現狀與趨勢，以期為我國水產疫苗開發與應用提供參考。

1 水產疫苗的發展歷程

水產疫苗的研究工作始于20世紀40年代。加拿大學者Duff［1］首次將滅活的鮭魚產氣單胞菌口服免疫應用于鱒魚（Salmo gairdneri）獲得成功，開創了水產疫苗的新紀元。20世紀70年代，北歐和北美鮭魚工業化養殖初期日益嚴重的病害促進了歐美等國積極開展水產疫苗的研制，由荷蘭Intervet公司率先推出的首例防治鮭魚弧菌病（Vibriosis）和腸型紅嘴病（Enteric redmouth disease）的福爾馬林細菌性滅活疫苗在北美鮭魚養殖生產中取得了巨大的商業成功，開啟了世界水產疫苗的商業化進程［2］。1988年，挪威法瑪克公司開發出抗冷水弧菌病的細菌滅活疫苗，并因此拯救了挪威的三文魚（Oncorhynchus keta）養殖產業。此后，世界首例癤點病細菌滅活魚疫苗、世界首例傳染性鮭魚貧血病（Infectious salmon anaemia，ISA）病毒疫苗和傳染性造血壞死（Infectious haematopoietic necrosis，IHN）病毒病疫苗相繼開發，使得歐洲的鮭魚養殖業的重大傳染性病害得到有效控制，并顯著減少了抗生素在水產養殖中的使用［2］。進入21世紀后，隨著基因工程技術的發展和人們對疫苗安全性認知的深入，以基因工程疫苗為主要特征的水產疫苗陸續被商業許可，如荷蘭英特威公司開發的鯰魚腸敗血病減毒活菌疫苗和鯰魚柱形病減毒活疫苗等。至2012年，據不完全統計，全球商業化生產的水產疫苗已超過140種［3］。

我國水產疫苗研究起步較晚，始于20世紀70年代［4］。早期研究的草魚出血病組織漿滅活疫苗（即土法疫苗）取得了一定的效果，從此拉開了我國水產疫苗研制的序幕［5］。1986年，通過草魚腎細胞（CIK）培養的草魚出血病病毒滅活疫苗取得了較好的免疫效果和較高的中和抗體效價，此后對草魚細菌性疫苗，如斑點氣單胞菌苗、草魚爛鰓病菌苗、腸炎菌苗等的研制也取得了較大的成果［5，6］。20世紀90年代初，對中華鱉嗜水氣單胞菌滅活菌苗以及海水鱸魚鰻弧菌口服微膠囊疫苗的研制進一步推動了我國漁用疫苗研制的進程［7，8］。近年來，隨著分子生物學、基因工程等學科的發展和國家科技投入的增加，我國水產疫苗研究掀開了嶄新的一頁，邁出了新的步伐。據統計，全國現有近30家科研單位開展水產疫苗相關研究，涉及包括病毒、細菌和寄生蟲等病原27種（類）［3］。到目前為止，有4個疫苗獲得國家新獸藥證書，分別為草魚出血病細胞滅活疫苗、魚用嗜水氣單胞菌滅活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌、遲緩愛德華菌病多聯抗獨特型抗體疫苗以及草魚出血病活疫苗；2011年初草魚出血病活疫苗生產使用的批準（農業部公告1525號）正式開啟了我國水產疫苗產業化進程。

2 水產疫苗的種類

水產疫苗按抗病原的種類可分為細菌疫苗、病毒疫苗和寄生蟲疫苗；按組成成分可分為單價疫苗、多價疫苗和混合疫苗（多聯疫苗）；按疫苗制備方式可分為活疫苗、滅活疫苗（包含土法疫苗）、亞單位疫苗及生物技術疫苗等。

2.1 活疫苗

在獸醫臨床中有強毒苗、弱毒苗和異源苗3種，目前水產活疫苗中應用較多的是用致病性已大為減弱的病毒減毒株或變異的弱毒株制備的疫苗，稱為弱毒疫苗，包括VHSV的F25（2 1）抗熱株苗、CCV減毒疫苗、癤瘡減毒疫苗、IHNV減毒疫苗和草魚出血癥細胞培養的弱毒疫苗［9，10］。弱毒疫苗接種后接近于自然感染，能夠有效激發魚體細胞免疫，并能在體內繁殖，因而疫苗用量少，免疫持續時間較長，且不必添加佐劑。但其不足之處主要是活疫苗在自然條件下安全性差，可能會導致病毒的轉變而在生態環境中失去控制；同時，活疫苗貯存運輸不方便，且保存期短。

2.2 滅活疫苗

滅活疫苗是經理化方法將病原微生物滅活，但其仍保持免疫原性，接種后使水生動物產生特異性抵抗力的疫苗。滅活疫苗研制周期短，使用安全，易于保存，但其接種后不能在體內繁殖，因此需要接種劑量較大，免疫持續時間短，且需要加入適當的佐劑以增強免疫效果。

此類疫苗包含多種組織漿滅活疫苗、弧菌滅活苗、嗜水氣單胞菌疫苗、鏈球菌疫苗，以及歐美國家鮭鱒魚養殖中常用的冷水病疫苗、VHS疫苗、PHV疫苗等。

2.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是去除病原體中與激發機體保護性免疫無關甚至有害的成分，但保留有效免疫原成分制作的疫苗。亞單位疫苗較全病毒疫苗除去了產生不良反應的物質，副作用減少。目前，水產上研究較多的是建立在細菌外膜蛋白、脂多糖等保護性抗原免疫原性成分基礎上的亞單位疫苗制備，但大部分還在試驗階段，沒有商業化生產。如利用細胞腫大虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）衣殼蛋白351R基因轉化大腸桿菌，經滅活處理后注射真鯛（Pagrosomus major）可對RSIV感染產生很好的免疫保護作用［11］。

亞單位疫苗以直接被合成或通過重組DNA技術生產，不含有病原的毒力因子，并且由基因工程菌表達，安全性好，生產簡單易控；使用時通常需添加佐劑，或與載體偶聯，以增強其免疫保護性。

2.4 基因工程疫苗

基因工程疫苗指應用重組DNA技術，將病原的保護性抗原基因在細菌、酵母或細胞等基因表達系統中體外表達，生產能誘導機體產生保護性免疫反應的病原蛋白質，再經過分離純化而制備的疫苗。應用基因工程技術能制備不含感染性物質的亞單位疫苗、穩定的減毒疫苗以及多價疫苗，其兼具亞單位疫苗的安全性和活疫苗的免疫效力。

目前，水產養殖上在研究應用的基因工程疫苗有IHNV、IPNV、FRV、鰻魚病毒和文蛤病毒等疫苗，其中傳染性胰臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）VP2重組亞單位疫苗是目前唯一商品化的魚用重組蛋白疫苗［9］。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗是將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內，被宿主細胞攝取后并轉錄和翻譯表達抗原蛋白，誘導機體產生非特異性和特異性免疫應答，從而起到免疫保護作用。DNA疫苗有別于其他疫苗之處在于它利用載體持續表達抗原，而不是直接使用抗原。與傳統疫苗相比，DNA疫苗具有可誘導更全面的免疫反應、穩定性更高、生產成本低、易于大規模生產等優點，且既具有減毒疫苗的優點，又無返毒的危險，被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，已成為水產疫苗研究和開發的熱點。

有關水產DNA疫苗的研究，最早見于1996年Anderson 等和Gomdz-Chiari 等［12，13］的實驗研究。雖然DNA 疫苗的研究工作起步較晚，但已取得了令人鼓舞的成就［14］。目前DNA疫苗主要集中在鮭鱒魚類IHNV、VHSV、桿狀病毒（SVCV）、鯉春病毒（SHRV）等傳染性病毒病的防治上，而挪威已批準使用一種可注射的、用病毒蛋白VP3 制作的抗IPN疫苗。

3 水產疫苗的接種方式

現階段，水產疫苗的接種主要有注射、口服、浸泡（或噴霧）3種方式。每種接種方式在疫病預防的實用性和成本與效益方面各有利弊，而開發疫苗的高效、合理的接種方式一直是水產疫苗研究的重要內容。

3.1 注射法

國內外水產疫苗以注射接種免疫為主。根據注射接種部位的不同可分為皮下注射、肌肉注射和腹腔（胸腔）注射3種，其中腹腔（胸腔）注射接種是疫苗接種的最常用方法。注射免疫能有效刺激機體產生相應抗體，具有用量少、抗體滴度高、免疫持續時間長等特點，但只適合較大規格個體，易引起機體的應激反應，而且費時費力。目前，國外已開發出專門的機器用于注射免疫，但國內尚未見相關報道。

3.2 浸泡（噴霧）法

繼Amend等［15］首次采用浸泡法進行魚類疫苗的免疫接種并獲得成功后，弧菌疫苗在大馬哈魚、日本鰻鱺和虹鱒的浸泡免疫中均獲得了成功。浸泡（噴霧）免疫方法操作簡單，適用于魚苗的大規模接種，且應激作用小。但直到目前為止，浸泡免疫中疫苗進入機體的路徑及作用機制尚不清晰，如疫苗是通過皮膚、鰓、側線還是其他部位進入機體、疫苗誘導的免疫是通過血液循環系統還是黏膜系統起作用等。此外，多種因素影響機體對浸泡免疫抗原的攝取，包括疫苗濃度、浸泡時間、水生動物大小、佐劑、抗原形態及水溫等［16，17］。

3.3 口服法

疫苗的口服免疫不受水產動物大小的限制，對其無任何應激作用，且方便、省時、省力。與其他免疫接種方法相比，口服法免疫更適合大規模養殖或分散養殖水產動物的免疫，尤其適合于多次重復免疫操作。

然而，口服疫苗在實際應用中易受胃腸道消化酶的消化，破壞其免疫原性。因此，目前有關口服疫苗的研究主要集中在探索一種有效的載體投遞系統，避免疫苗受消化酶及酸環境的影響。如采用海藻酸鹽、PLGA、PELA等可降解生物高分子材料包裹全菌疫苗等研究取得了良好的免疫效果；致力于建立一種能在飼料和水生動物胃腸道中保持疫苗抗原穩定性系統的口服微球緩釋疫苗研究也已取得重要進展。

4 水產疫苗關鍵技術發展現狀與趨勢

4.1 水產疫苗制備技術

自1942年殺鮭氣單胞菌滅活疫苗問世以來，目前世界上商品化的水產疫苗仍以滅活疫苗為主，而通過理化方法將強毒野生型病原滅活仍是疫苗制備的主要技術。隨著分子生物學技術的發展進步，水產疫苗的研制有了更多的技術手段，如重組亞單位制備技術、基因缺失減毒技術、基因工程活載體技術和DNA疫苗制備技術等。應用分子生物學技術制備的疫苗具有諸多優點：化學性質更為確定，免疫特性穩定；化學結構可知，可以進行工程設計和改造以激發特定的免疫反應；除去感染成分，不存在殘余毒性或毒性回復的隱患；可直接合成或通過重組DNA技術生產，便于工廠化生產，且可以朝多價疫苗研制方向發展。20多年來，水產疫苗基因工程制備技術發展迅速，但依然存在諸如疫苗安全、作用機理不清晰等問題和不足之處，隨著免疫學和基因工程技術的研究深入，這將是水產疫苗制備技術的重要發展方向和研究熱點。

4.2 水產疫苗佐劑的應用

疫苗佐劑是指與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型的物質。佐劑在增加疫苗抗原的表面積，延長其在體內的存留時間，增強巨噬細胞和免疫相關細胞的活性，提高細胞介導的致敏反應能力，加快抗體產生和提高抗體水平等方面均起到了重要作用。

佐劑是伴隨著疫苗的研制而被發現和發展的，而最早、最廣泛應用于商品化疫苗的佐劑是礦物油佐劑和礦物鹽佐劑［3］。20世紀80年代以來，生物來源的佐劑得到了較好發展，如植物來源佐劑、細菌來源佐劑（脂多糖、霍亂毒素、鞭毛蛋白等）、細胞因子佐劑和核酸佐劑等［18-22］。20世紀90年代，隨著納米技術和材料的發展，納米微球佐劑研究取得了飛速發展，其具有副作用少、緩釋、長效、避免胃腸道消化水解等優點［23-25］。近年來，殼聚糖、海藻酸鈉微球佐劑制備工藝日趨成熟，并得到了較好的應用。

基于疫苗佐劑在疫苗免疫中的重要作用，新型疫苗佐劑的開發和應用將是水產疫苗研究的重要課題，其重點研究方向包括：新型疫苗佐劑的開發與效果探討；疫苗佐劑的作用機理；合適疫苗佐劑的選擇；疫苗佐劑安全性及其評價方法等。

4.3 水產疫苗免疫基礎理論研究

水產動物基礎免疫學研究的不完善，加之水產動物跨越的物種范圍大、種類多；同時，疫苗的免疫時機、免疫方式、免疫次數和加強免疫的時間等免疫機理還缺乏大量的實驗數據和資料支持。以上因素均嚴重制約了水產疫苗的研制和應用。因此，加強水產疫苗學基礎理論研究尤為重要。開展水產動物的免疫系統及其功能、抗原分子誘導水產動物機體產生反應的過程和免疫應答規律、病原體結構、功能、生物學性質、水產疫苗設計、制作的技術基礎及方法學、漁用疫苗的免疫效果與環境、機體之間的關系等研究將是水產疫苗研究的又一重要方向。

5 結語

綜上所述，水產疫苗的研究開發工作正在全世界范圍內蓬勃發展，隨著生物技術的不斷進步，水產疫苗的使用也呈快速發展勢頭，并將有效解決因化學藥物濫用而導致的水產品質量安全和環境污染問題。在我國，水產疫苗的研制是個新興產業，面臨的問題依然很多，但是，充分利用水產動物免疫防御系統機能，開發出高效、實用及多樣化的水產疫苗，是今后水產養殖動物病害防治的必由之路。未來，我國疫苗研發工作應緊跟國際前沿，結合現階段的基礎，面向水產養殖生產實際，從多方面開展相關技術研究，促進我國水產養殖的健康和可持續發展。

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（責任編輯 狄艷紅）

Development Status and Trend Analysis in Aquaculture Vaccines

Wang Zhongliang1Wang Bei1Lu Yishan1Wu Zaohe2
（1. Fishery College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Aquaculture vaccines not only boost immunity of aquatic animals and prevent aquaculture diseases， but also reduce the use of drugs， lower the cost of aquaculture reproduction and solve problems of food safety and environment pollutions caused by drug residues， and finally lead aquaculture to develop in the green and sustainable direction. As thus， aquaculture vaccines become one of the research hotspots in the diseases control for aquatic animals. In this paper， the history of vaccine development， vaccine types， and vaccine delivery methods are summarized. The status and trend of key technologies in aquaculture vaccines are introduced.

aquaculture vaccines；vaccine types；delivery methods；status and trend

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.008

2014-11-26

國家自然科學基金項目（31202023），國家海洋局公益性行業科研專項（201205028-2），廣東海洋大學優秀青年骨干教師特別資助計劃（2014001）

王忠良，男，博士研究生，講師，研究方向：水產動物生物學；E-mail：leong2006@126.com

吳灶和，教授，博士生導師，研究方向：水產動物病害防治；E-mail：wuzaohe@163.com