NF-κB抑制劑Bay 11-7082對人胰腺癌細胞株SW1990增殖和凋亡的影響

張三軍

目前胰腺癌的發病率占人類全身腫瘤的1%~3%，在消化道腫瘤中的比例為8%~10%[1]。胰腺癌明確診斷時多已是進展期，未做治療的胰腺癌中位生存期為3~4個月[2]。目前手術是根治胰腺癌的唯一方法，但胰腺癌手術切除率僅5%~15%，且根治術后5年生存率仍低于5%[3]。因此在當前條件下，化療對于改善進展期胰腺癌患者的生活質量，以及延長患者生存期起到非常重要的作用，吉西他濱作為當前治療進展期胰腺癌的首選化療藥物，但吉西他濱單獨治療胰腺癌的效果也不甚理想，主要原因主要在于胰腺癌細胞獲得性或內在的耐藥性[4-5]。

NF-κB為一種快反應的核轉錄因子，與人類多種疾病的發生有著密切的聯系[6]。在胰腺等組織細胞癌變的過程中也起到重要作用。NF-κB通常與其抑制蛋白IκB結合成無活性的三聚體存留于胞質，當IκB磷酸化而降解后，NF-κB激活并入核與相應靶基因結合，特別是RelA（p65）亞基可反式激活很多基因，如細胞周期素D1、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶（MMP）、多藥耐藥基因（MDR）等，進而調節腫瘤細胞增殖、凋亡抵抗、血管生成、侵襲轉移和耐藥等生物學行為[7-11]。而傳統化療藥物如吉西他濱和依托泊苷等能激活腫瘤細胞的NF-κB[10-12]，進而引起胰腺癌細胞對化療藥物的耐藥。另外有研究表明姜黃素和百里醌等療法能下調胰腺癌細胞活性NF-κB水平，而姜黃素或百里醌在聯合吉西他濱治療胰腺癌時能顯著增強吉西他濱對胰腺癌細胞的細胞毒作用，從而一定程度上逆轉胰腺癌細胞的耐藥性[10-11]。因此，NF-κB在促進胰腺癌細胞生存和抑制細胞凋亡中發揮重要作用，抑制NF-κB能有效殺滅胰腺癌細胞。

本研究通過Bay 11-7082抑制IκB磷酸化而阻斷NF-κB通路，觀察其對胰腺癌細胞生長和凋亡的影響，并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NF-κB抑制劑Bay 11-7082、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物發展有限公司；Bax抗體購自美國Epitomics公司；caspase-3抗體購自美國Abcam公司。

1.2 藥物配制 NF-κB抑制劑Bay 11-7082用DMSO配成30 μmol/L，-20 ℃冰箱保存（DMSO的終濃度小于0.1%）。

1.3 細胞培養 人胰腺癌細胞株SW1990購自ATCC，培養在含l5%胎牛血清、質量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham’ s F-12K培養液中，置于培養條件為37 ℃、5%的CO2的培養箱內培養，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞單層貼壁生長至70%~80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.4 細胞形態學觀察 取1 mL濃度為5×104/mL的SW1990細胞懸液接種于載玻片上，待細胞過夜貼壁后，第2天更換培養液，加入不同濃度Bay 11-7082（2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L）培養 2 h，光學顯微鏡下觀察。及甲醛固定后，DAPI染色5 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將處于對數生長期的SW1990細胞制成單細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種到96孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培養2 h，PBS洗脫后繼續培養24 h，同時設置空白對照調零，以及陰性對照組（細胞中僅加入等量的0.1% DMSO溶液）。藥物作用結束前1 h，各孔加入CCK-8 0.01 mL，繼續培養1 h，放置于酶標儀處測A450值，實驗重復3次。

細胞存活率=（實驗組OD值-空白調零OD值）/（對照組OD值-空白調零OD值）×100%。1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 取1 mL濃度為5×105/mL的SW1990細胞懸液于6孔培養板中，待細胞生長至90%融合后，分別加入不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培養2 h，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，先加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL碘化丙啶（PI），在室溫下避光反應15 min，立即用流式細胞儀進行檢測。

1.7 Western blot法檢測胰腺癌細胞中caspase-3和Bax表達 收集處于對數生長期的SW1990細胞，Bay 11-7082處理同上，裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20 μg/孔），常規8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1：2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）軟件分析，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.8 統計學處理 使用SPSS 11.5軟件包進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，正態分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學改變 光學顯微鏡下胰腺癌細胞SW1990經不同濃度Bay 11-7082處理過后，在倒置顯微鏡下觀察到貼壁的正常胰腺癌細胞數逐漸減少，細胞間距變大，部分細胞體積縮小，脫落漂浮的細胞增多。細胞經DAPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察到Bay 11-7082處理后細胞核出現固縮、染色體凝集和出現凋亡小體等典型凋亡特征性改變，以高濃度Bay 11-70829（10 μmol/L）作用效果最為顯著。表明Bay 11-70829可誘導胰腺癌細胞株SW1990凋亡。

2.2 Bay 11-7082對SW1990細胞的增殖抑制作用 Bay 11-7082對SW1990細胞的增殖抑制作用呈現一定的劑量依賴性，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082作用SW1990細胞2 h后正常培養24 h，細胞存活率分別為（72.8±11.05）%、（65.1±13.26）%和（55.8±14.55）%；用藥組OD值均明顯低于空自對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 Bay 11-7082對SW1990細胞凋亡的影響 用流式細胞術檢測細胞凋亡，見圖2，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082 作用 SW1990細胞2 h后正常培養24 h，用流式細胞儀檢測分析，對照組僅產生0.4%~1.0%的早期凋亡細胞，2.5 μM、5 μM 和 10 μM Bay 11-7082 組分別誘導（6.7±1.44）%、（10.1±2.37）%和（17.2±2.46）%的細胞發生早期凋亡，呈濃度依賴性，與對照組相比均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 Bay 11-7082對SW1990細胞中caspase-3和Bax表達的影響 Western印跡表明在胰腺癌SW1990細胞中，NF-κB抑制劑Bay 11-7082可激活人胰腺癌SW1990細胞中caspase-3以及上調Bax的表達，呈一定的濃度依賴性。

圖1 人胰腺癌SW1990細胞形態學變化

圖2 不同濃度Bay 11-7082對SW1990細胞凋亡率的影響

圖3 Bay 11-7082對SW1990細胞中caspase-3和Bax蛋白表達的影響

3 討論

Wang等[13]首次對NF-κB在胰腺癌中的表達進行研究中發現，11種胰腺癌細胞系中有9種細胞系中NF-κB曾持續激活狀態，而在正常胰腺組織中未見明顯NF-κB激活表達；在胰腺癌動物模型中NF-κB也呈持續激活狀態[10-12]；Dong[14]和Patel[15]研究發現，激活后的NF-κB可對抗細胞發生凋亡，從而導致腫瘤細胞對凋亡的耐受，引起腫瘤細胞對化療藥物的耐藥。因此，下調NF-κB對胰腺癌細胞有一定的增殖抑制作用。Kuo[16]報道NF-κB抑制劑PDTC能增強凋亡誘導劑對大鼠膠質瘤細胞的增殖抑制作用；Arlt[17]報道NF-κB抑制劑sulfasalazine可增強人胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性；García[18]報道NF-κB抑制劑Bay 11-7082能誘導多重耐藥白血病細胞發生凋亡。本研究中發現NF-κB抑制劑Bay 11-7082能對人胰腺癌SW1990細胞產生一定的增殖抑制和誘導凋亡的作用，在一定范圍內隨著Bay 11-7082濃度的增大，對胰腺癌細胞生長的抑制作用越來越明顯，同時也誘導更多細胞發生凋亡。CCK-8實驗結果和FCM檢測結果較一致，表明Bay 11-7082對胰腺癌細胞生長的影響主要是通過誘導細胞凋亡方式為主，與文獻報道一致。

細胞發生凋亡時，激活的NF-κB進入核內，促使Bcl-2家族蛋白成員中Bcl-2表達上調，Bcl-2可阻止細胞通過線粒體通道發生凋亡；而另一Bcl-2家族蛋白成員-Bax可對抗凋亡抑制蛋白Bcl-2的作用，從而誘導細胞發生凋亡[19]；而caspase蛋白酶在死亡受體介導的細胞凋亡過程中起著關鍵的作用[20]，caspase蛋白酶在正常細胞中以非活化形式存在[21]，caspase-3作為細胞凋亡過程中最主要的終末效應酶，在級聯效應中被caspase-8和9等激活[22]，活化的caspase-3裂解聚合酶PARP和D4-GDI蛋白[23]，從而觸發凋亡發生。Banerjee[10]報道百里醌不僅能下調NF-κB，還能活化caspase-3以及上調Bax水平從而誘導胰腺癌細胞凋亡，還有報道caspase抑制劑能有效抑制腫瘤細胞凋亡。本研究中western印跡表明NF-κB抑制劑Bay 11-7082能激活胰腺癌SW1990細胞caspase-3和上調Bax水平，呈一定的濃度依賴性，與文獻報道相符。因此，筆者認為，NF-κB抑制劑Bay 11-7082可能部分通過活化caspase-3和上調Bax水平從而誘導胰腺癌SW1990細胞發生凋亡。

總之，本研究結果顯示應用NF-κB抑制劑Bay 11-7082可以有效抑制人胰腺癌細胞株SW1990增殖，誘導細胞發生凋亡，其部分機制可能是通過活化Caspase-3和上調Bax表達水平實現。

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